JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Escherichia coli-baserade Cell-Free proteinsyntes: protokoll för en robust, flexibel och lättillgänglig plattform teknik

Published: February 25, 2019
doi:
10.3791/58882
, , , ,
1Department of Biological Sciences,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry,California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering,Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute,Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology,Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program,Northwestern University

Summary

Detta protokoll uppgifter om åtgärder, kostnader och utrustning krävs för att generera E. coli-baserade cell extrakt och genomföra in vitro- proteinsyntes reaktioner inom 4 dagar eller mindre. För att utnyttja flexibiliteten i denna plattform för bred applikationer, diskutera vi reaktionsbetingelser som kan anpassas och optimeras.

Abstract

Under de senaste 50 åren, har Cell-Free Protein syntes (CFPS) framträtt som en kraftfull teknik för att utnyttja den transkriptionell och translationell kapaciteten hos celler i ett provrör. Genom att undanröja behovet av att upprätthålla livskraften i cellen, och genom att eliminera cellulära barriären, har CFPS varit grundläggande för nya tillämpningar inom biomanufacturing av traditionellt utmanande proteiner, samt applikationer i rapid prototyping för metaboliska teknik och funktionsgenomik. Våra metoder för att implementera en E. coli-baserad plattform som CFPS ge nya användare åtkomst till många av dessa program. Här, beskriver vi metoder för att förbereda extrakt med hjälp av berikade media, förbryllad kolvar och en reproducerbar metod för avstämbara ultraljudsbehandling-baserade cellys. Detta extrakt kan sedan användas för proteinuttryck kan producera 900 µg/mL eller mer av super mapp grönt fluorescerande protein (sfGFP) i bara 5 h från experiment till dataanalys, med tanke på att lämpliga reagens bestånd har upprättats i förväg. Beräknad start kostar att erhålla reagenser $4.500 som kommer att stödja tusentals reaktioner till en beräknad kostnad av $0,021 per µg av protein som produceras eller $0,019 per µL av reaktion. Dessutom spegel protein uttryck metoderna användarvänlighet reaktion setup sett i kommersiellt tillgängliga system på grund av optimering av reagens premixer, till en bråkdel av kostnaden. För att möjliggöra för användaren att utnyttja flexibiliteten i CFPS plattformen för breda program, har vi identifierat en mängd olika aspekter av den plattform som kan vara trimmad och optimerad beroende på tillgängliga resurser och protein uttryck utfallen önskas.

Introduction

Cellfria Protein syntes (CFPS) har vuxit fram som en teknik som har låst upp ett antal nya möjligheter för proteinproduktion, Funktionsgenomik, metabola engineering och mer inom de senaste 50 år1,2. CFPS jämfört med standard i vivo protein uttryck plattformar, och ger tre viktiga fördelar: 1) cell-fri natur av plattformen möjliggör produktion av proteiner som skulle vara potentiellt giftiga eller utländska till cell3,4 ,5,6. (2) inaktivering av genomisk DNA och införandet av en mall DNA kodning av gene(s) av intresse kanalisera all den systemiska energin inom reaktionen till produktionen av proteinernas av intresse. och 3) öppna karaktär av plattformen ger användaren möjlighet att ändra och övervaka reaktion villkor och sammansättning i realtid7,8. Denna direkta tillgång till reaktionen stöder augmentation av biologiska system med utökade kemier och redox förutsättningar för produktion av nya proteiner och trimning av metaboliska processer2,9, 10. direkt tillgång tillåter även användaren att kombinera CFPS reaktionen med aktivitet-analyser i ett singel-pot system för snabbare design-build-test cykler11. Kapacitet att utföra CFPS reaktionen i liten volym droppar eller på papper-baserade enheter ytterligare stöder hög genomströmning discovery ansträngningar och prototyper12,13,14,15 ,16. Grund av dessa fördelar och den plug and play typ av systemet, har CFPS unikt möjliggjort en mängd biotekniska tillämpningar såsom produktion av proteiner som är svåra att solubly express i vivo17, 18,19,20, upptäckt av sjukdom21,22,23, på efterfrågan biomanufacturing18,24 ,25,26,27, och utbildning28,29, varav alla Visa flexibilitet och nyttan av cellfria plattformen.

CFPS system kan genereras från en mängd rå lysates från båda prokaryota och eukaryota cellinjer. Detta möjliggör olika alternativ i systemet för val, som alla har för- och nackdelar beroende på tillämpningen av intresse. CFPS system varierar också kraftigt i förberedelsetid, kostnader och produktivitet. Mest utnyttjas vanligen cell extrakt produceras från vetegroddar, kanin retikulocyter, insekt celler och Escherichia coli celler, med den sistnämnda är den mest kostnadseffektiva hittills samtidigt som det producerar högsta volymetriska avkastningarna av protein30 . Medan andra CFPS system kan vara fördelaktiga för deras medfödda posttranslationella modifieringen maskiner, framväxande program med hjälp av E. coli-baserade maskiner ska kunna överbrygga klyftan genom att generera anläggningsvis fosforyleras och Glykosylerat proteiner på efterfrågan31,32,33,34,35.

CFPS reaktioner kan köras i antingen batch, kontinuerlig-exchange cellfria (CECF) eller kontinuerlig flöde cell-fri (CFCF) format. Det batch-formatet är ett slutet system vars reaktion livstid är begränsad på grund av minskande mängder reaktanterna och ansamling av inhiberande biprodukter av reaktionen. CECF och CFCF metoder öka livslängden av reaktionen och resultera därmed i ökat volymetriska protein avkastning jämfört med batch reaktionen. Detta åstadkoms genom att låta biprodukter av proteinsyntesen ska tas bort från reaktionskärlet medan nya reaktanterna levereras under hela den reaktion2. När det gäller CFCF, kan proteinet av intresse också tas bort från reaktionskammaren, medan i CECF, proteinet av intresse förblir i reaktionskammaren består av en halvgenomträngligt membran36,37. Dessa metoder är särskilt värdefullt att övervinna dåliga volymetriska avkastningarna av svårt-att-express proteiner av intresse38,39,40,41,42, 43. Utmaningarna i genomförandet av de CECF och CFCF strategier är att 1) medan de resulterar i effektivare användning av den bio maskinen ansvarar för transkription och translation, de kräver framför allt större mängder reagens som ökar totalkostnad och 2) de kräver mer komplex reaktion uppställningar och specialutrustning jämfört med de batch format44. För att säkerställa tillgänglighet för nya användare, beskrivs protokoll som häri fokus på batch format på reaktion volymer av 15 µL med specifika rekommendationer för att öka volymen reaktion till milliliter skalan.

De metoder som presenteras häri aktivera icke-experter med grundläggande laboratorium färdigheter (t.ex. studenter) att genomföra celltillväxt, extrahera förberedelse och batch-format reaktion setup för en E. coli-baserat CFPS system. Detta tillvägagångssätt är kostnadseffektiv jämfört med kommersiellt tillgängliga kit utan att offra lättheten av kit-baserade reaktion setup. Dessutom kan detta tillvägagångssätt program i laboratorium och i fält. När man beslutar att genomföra CFPS, bör nya användare grundligt utvärdera effekten av konventionell protein uttryck system för start investeringar, eftersom CFPS inte kanske är överlägsen i varje fall. CFPS metoderna som beskrivs här möjligt för användaren att direkt genomföra en mängd olika tillämpningar, inklusive Funktionsgenomik, hög genomströmning provning, produktion av proteiner som är svårlösta för i vivo uttryck, samt fältet applikationer inklusive biosensorer och utbildningspaket för syntetisk biologi. Ytterligare applikationer såsom metabola engineering, trimning av protein uttryck villkor, sjukdom upptäckt och skala upp med CECF eller CFCF metoder är fortfarande möjligt men kan kräva erfarenhet med CFPS plattform för vidare modifiering av reaktion villkor. Våra metoder kombinera tillväxt i berikade media och förbryllad kolvar, med relativt snabba och reproducerbara metoder för cellys genom ultraljudsbehandling, följt av en förenklad CFPS reaktion installation som använder optimerade premixer45. Medan de cellulära tillväxt metoderna har blivit något standardiserat inom fältet, varierar metoder för cellen lysis kraftigt. Utöver ultraljudsbehandling inkluderar vanliga lysis metoder utnyttjandet av en fransk press, en Homogenisatorer, pärla visparna, eller lysozym och andra biokemiska och fysiska störningar metoder46,47,48, 49. med våra metoder, ca 2 mL av rå cell extrakt erhålls per 1 L av celler. Denna kvantitet av cell extrakt kan stödja fyra hundra 15 µL CFPS reaktioner, varje producerande ~ 900 µg/mL reporter sfGFP protein från den mall plasmiden pJL1-sfGFP. Denna metod kostar $ 0,021/µg av sfGFP produceras ($.019/µL av reaktion), exklusive kostnader för arbetskraft och utrustning (kompletterande figur1). Start från scratch, denna metod kan genomföras på 4 dagar av en enda person och upprepa CFPS reaktioner kan slutföras inom timmar (figur 1). Protokollet kan dessutom skalas upp i volym för större partier av REAGENSBEREDNING att passa användarens behov. Ännu viktigare, kan det protokoll som presenteras här genomföras genom laboratoriet utbildade icke-experter såsom studenter, eftersom det kräver endast grundläggande laboratorium färdigheter. De förfaranden som beskrivs nedan, och medföljande videon har utvecklats speciellt för att förbättra tillgängligheten av E. coli CFPS plattform för bred användning.

Protocol

1. Media förberedelse och celltillväxt Dag 1 Strimma E. coli BL21*(DE3) celler från en glycerol lager på en LB agarplattan och Inkubera under minst 18 timmar vid 37 ° C. Förbereda 50 mL LB media och autoklav lösningen på en flytande cykel under 30 minuter vid 121 ° C. Förvara i rumstemperatur. Dag 2 Förbereda 750 mL 2 x YTP media och 250 mL 0,4 M D-glukos lösning som beskrivs i den kompletterande infor…

Representative Results

Vi har lagt fram en ultraljudsbehandling-baserade E. coli extrahera förberedelse protokoll som kan kompletteras under en fyra dagars span, med figur 1 visar den processuella fördelningen över varje dag. Det finns formbarhet med steg som kan genomföras på varje dag med olika pausa punkter, men vi har funnit detta arbetsflöde ska vara den mest effektiva att utföra. Dessutom är både cell pellets (steg 1.3.18) och fullt beredd extrakt (steg 2.10…

Discussion

Cellfria proteinsyntesen har vuxit fram som en kraftfull och möjliggörande teknik för en mängd tillämpningar som sträcker sig från biomanufacturing till prototyper av biokemiska system. Bredden av program stöds av kapaciteten att övervaka, manipulera och öka cellulära maskineriet i realtid. Trots den växande effekten av denna plattform teknik, bred anpassning har varit långsam på grund av tekniska nyanser i genomförandet av metoder. Genom denna insats vill vi att enkelhet och tydlighet för att upprätta d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill erkänna Dr Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher, och Tony Turretto för teknisk support, Wesley Kao, Layne Williams, och Christopher Hight för bra diskussioner. Författarna erkänner också finansiellt stöd från Bill och Linda Frost fonden, Center för applikationer inom bioteknikens Chevron bioteknik tillämpas Endowment forskningsbidrag, Cal Poly forskning, Scholarly och kreativa aktiviteter Grant Program (RSCA 2017), och National Science Foundation (NSF-1708919). MZL erkänner California State University Graduate bidraget. MCJ erkänner den armén forskning Office W911NF-16-1-0372, beviljar National Science Foundation MCB-1413563 och MCB-1716766, de flygvapen forskning laboratorium Center av Excellence Grant FA8650-15-2-5518, Defense Threat minskning byrån bidraget HDTRA1-15-10052/P00001, David och Lucile Packard Foundation, programmet Camille Dreyfus lärare-forskare, Institutionen för energi BER Grant DE-SC0018249, den mänskliga gränser Naturvetenskapsprogrammet (RGP0015/2017), DOE Joint Genome Institute ETOP bidraget, och Chicago biomedicinsk konsortiet med stöd från Searle fonderna på the Chicago Community Trust för stöd.

Materials

Luria Broth ThermoFisher 12795027
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
DTT ThermoFisher 15508013
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
NH4(Glu) MP Biomedicals 02180595.1
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
HEPES ThermoFisher 11344041
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL Fisher Scientific 05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL Fisher Scientific 05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50Hz 3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
Cytation 5 BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA 2-4998-000
pJL1-sfGFP Addgene 69496
BL21(DE3) New England BioLabs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and Systems Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  2. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  3. Watanabe, M. Cell-Free Protein Synthesis for Structure Determination by X-ray Crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 607, 149-160 (2010).
  4. Martemyanov, K. A., Shirokov, V. A., Kurnasov, O. V., Gudkov, A. T., Spirin, A. S. Cell-Free Production of Biologically Active Polypeptides: Application to the Synthesis of Antibacterial Peptide Cecropin. Protein Expression and Purification. 21 (3), 456-461 (2001).
  5. Renesto, P., Raoult, D. From genes to proteins: in vitro expression of rickettsial proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 990, 642-652 (2003).
  6. Xu, Z., Chen, H., Yin, X., Xu, N., Cen, P. High-Level Expression of Soluble Human b-Defensin-2 Fused With Green Fluorescent Protein in Escherichia coli Cell-Free System. Applied Biochemistry and Biotechnology. 127 (1), 053-062 (2005).
  7. Baumann, A. In-situ observation of membrane protein folding during cell-free expression. PLoS ONE. 11 (3), 1-15 (2016).
  8. Wang, Y., Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnology. 9, 1-8 (2009).
  9. Whittaker, J. W. Cell-free protein synthesis: the state of the art. Biotechnology Letters. 35 (2), 143-152 (2013).
  10. Martin, R. W. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. 9 (1), 1203 (2018).
  11. Kwon, Y. C., Song, J. K., Kim, D. M. Cloning-Independent Expression and Screening of Enzymes Using Cell-Free Protein Synthesis Systems. Methods in Molecular Biology. 1118, 97-108 (2014).
  12. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  13. Takahashi, M. K. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  14. Karim, A. S., Jewett, M. C. A cell-free framework for rapid biosynthetic pathway prototyping and enzyme discovery. Metabolic Engineering. 36, 116-126 (2016).
  15. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-Free Mixing of Escherichia coli Crude Extracts to Prototype and Rationally Engineer High-Titer Mevalonate Synthesis. ACS Synthetic Biology. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  16. Pardee, K. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  17. Zawada, J. F. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Sullivan, C. J. A cell-free expression and purification process for rapid production of protein biologics. Biotechnology Journal. 11 (2), 238-248 (2016).
  19. Li, J. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal. 11 (2), 212-218 (2016).
  20. Heinzelman, P., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. pH responsive granulocyte colony-stimulating factor variants with implications for treating Alzheimer’s disease and other central nervous system disorders. Protein Engineering Design and Selection. 28 (10), 481-489 (2015).
  21. Pardee, K. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  22. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  23. Gootenberg, J. S. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  24. Pardee, K. Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  25. Karig, D. K., Bessling, S., Thielen, P., Zhang, S., Wolfe, J. Preservation of protein expression systems at elevated temperatures for portable therapeutic production. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (129), (2017).
  26. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. BioTechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
  27. Hunt, J. P., Yang, S. O., Wilding, K. M., Bundy, B. C. The growing impact of lyophilized cell-free protein expression systems. Bioengineered. 8 (4), 325-330 (2017).
  28. Stark, J. C. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  29. Huang, A. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  30. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  31. Oza, J. P. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications. 6 (1), 8168 (2015).
  32. Zemella, A. Cell-free protein synthesis as a novel tool for directed glycoengineering of active erythropoietin. Scientific Reports. 8 (1), 8514 (2018).
  33. Jaroentomeechai, T. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nature Communications. 9 (1), 2686 (2018).
  34. Kightlinger, W. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nature Chemical Biology. 14 (6), 627-635 (2018).
  35. Schoborg, J. A. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  36. Chekulayeva, M. N., Kurnasov, O. V., Shirokov, V. A., Spirin, A. S. Continuous-Exchange Cell-Free Protein-Synthesizing System: Synthesis of HIV-1 Antigen Nef. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (3), 914-917 (2001).
  37. Hong, S. H. Improving Cell-Free Protein Synthesis through Genome Engineering of Escherichia coli Lacking Release Factor 1. ChemBioChem. 16 (5), 844-853 (2015).
  38. Endo, Y., Otsuzuki, S., Ito, K., Miura, K. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. Journal of Biotechnology. 25 (3), 221-230 (1992).
  39. Volyanik, E. V., Dalley, A., Mckay, I. A., Leigh, I., Williams, N. S., Bustin, S. A. Synthesis of Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin-6 Using a Continuous-Flow Cell-Free Translation System. Analytical Biochemistry. 214 (1), 289-294 (1993).
  40. Martin, G. A., Kawaguchi, R., Lam, Y., DeGiovanni, A., Fukushima, M., Mutter, W. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. BioTechniques. 31 (4), 948-950 (2001).
  41. Stech, M., Quast, R. B., Sachse, R., Schulze, C., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. A Continuous-Exchange Cell-Free Protein Synthesis System Based on Extracts from Cultured Insect Cells. PLoS ONE. 9 (5), e96635 (2014).
  42. Quast, R. B., Sonnabend, A., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield cell-free synthesis of human EGFR by IRES-mediated protein translation in a continuous exchange cell-free reaction format. Scientific Reports. 6 (1), 30399 (2016).
  43. Thoring, L., Dondapati, S. K., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield production of "difficult-to-express" proteins in a continuous exchange cell-free system based on CHO cell lysates. Scientific Reports. 7 (1), 11710 (2017).
  44. Hoffmann, M., Nemetz, C., Madin, K., Buchberger, B. Rapid translation system: A novel cell-free way from gene to protein. Biotechnology annual review. 10, 1-30 (2004).
  45. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  46. Katsura, K. A reproducible and scalable procedure for preparing bacterial extracts for cell-free protein synthesis. Journal of Biochemistry. 162 (June), 357-369 (2017).
  47. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 1-15 (2016).
  48. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  49. Krinsky, N. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  50. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  51. Swartz, J. R., Jewett, M. C., Woodrow, K. A. Cell-Free Protein Synthesis With Prokaryotic Combined Transcription-Translation. Recombinant Gene Expression. (267), 169-182 (2004).
  52. Voloshin, A. M., Swartz, J. R. Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode. Biotechnology and Bioengineering. 91 (4), 516-521 (2005).
  53. Vernon, W. B. The role of magnesium in nucleic-acid and protein metabolism. Magnesium. 7 (5-6), 234-248 (1988).
  54. Pratt, J. M. . Transcription and Translation: A Practical Approach. , (1984).
  55. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A Highly Efficient Cell-Free Protein Synthesis System from Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 239 (3), 881-886 (1996).
  56. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4 (1), 8 (2010).
  57. Zubay, G. In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics. 7 (1), 267-287 (1973).
  58. Kigawa, T. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1/2), 63-68 (2004).
  59. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 Extract Preparation for Economical Cell-Free Protein Synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2008).
  60. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  61. Foshag, D. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40 (Pt B), 245-260 (2018).
  62. Caschera, F. Bacterial cell-free expression technology to in vitro systems engineering and optimization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2 (2), 97-104 (2017).
  63. Chizzolini, F., Forlin, M., Yeh Martín, N., Berloffa, G., Cecchi, D., Mansy, S. S. Cell-Free Translation Is More Variable than Transcription. ACS Synthetic Biology. 6 (4), 638-647 (2017).
  64. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, 34 (2014).
  65. Sawasaki, T., Ogasawara, T., Morishita, R., Endo, Y. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14652-14657 (2002).
  66. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: Biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  67. Garcia, D. C. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3 (1), 1-9 (2018).
  68. Hurst, G. B. Proteomics-Based Tools for Evaluation of Cell-Free Protein Synthesis. Analytical Chemistry. 89 (21), 11443-11451 (2017).

Tags

Escherichia ColiCell-free Protein SynthesisProtocolPlatform TechnologyFunctional GenomicsBiosensorsMetabolic EngineeringGenetic Code ExpansionCentrifugationS30 BufferDTTResuspensionAliquoting
check_url/58882?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J. Vis. Exp. (144), e58882, doi:10.3791/58882 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image