Summary
Messung der in-vitro-Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument als Biomarker für Atherosklerose. In der vorliegenden Studie wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.
Abstract
Arteriosklerose führt zu Herz-Kreislauf-Krankheit (CVD). Es ist noch unklar, ob Cholesterin HDL (cHDL) Konzentration spielt eine ursächliche Rolle in der Entwicklung von Atherosklerose. Allerdings ist ein wichtiger Faktor in frühen Stadien der Atherom Plaquebildung Cholesterin Efflux Fähigkeit, HDL (die Fähigkeit der HDL-Partikel, Cholesterin aus Makrophagen anzunehmen) um Zelle Schaumbildung zu vermeiden. Dies ist ein wichtiger Schritt bei der Vermeidung der Anhäufung von Cholesterin in das Endothel und ein Teil des umgekehrten Cholesterin-Transport (RCT), Cholesterin durch die Leber zu beseitigen. Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument, das als Biomarker für Atherosklerose verwendet werden kann. Traditionell, [3H]-Cholesterin in Cholesterin-Efflux-Assays verwendet worden. In dieser Studie wollen wir ein sicherer und schneller mit fluoreszierenden gekennzeichnet-Cholesterin (NBD-Cholesterin)-Strategie in einem zellulären Assay, den Cholesterin Aufnahme und Fluth Prozess in THP-1-derived Makrophagen zu verfolgen. Endlich, wir optimieren und standardisieren die NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.
Introduction
Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sind die aktuellen wichtigsten Todesursachen weltweit ischämischen Herzkrankheiten und Schlaganfall (Buchhaltung für insgesamt 15,2 Millionen Todesfälle)1. Beide sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), die Arteriosklerose und der Bruch des Atheroms Plaques in Blutgefäßen2,3vorangestellt werden können.
Atherosklerose ist ein Schiff Wand entzündliche Erkrankung in der T-Zellen, Makrophagen, Mastzellen und dendritischen Zellen infiltrieren das Endothel und sammeln aus dem Blut, schließlich bildet arteriosklerotische Plaques. Arteriosklerotische Plaques präsentieren ein Lipid Kern und Cholesterin-Kristalle, belegt durch hochauflösende B-Mode Sonographie Messungen der a. carotis Intima Media Dicke4,5. In Makrophagen wird Cholesterin Efflux zur Lipid-Akzeptor-Partikel mit Mitteln der ATP-bindende Kassette (ABC) Rezeptoren ABCA1, ATP verbindliche Kassette Unterfamilie G Mitglied 1 (ABCG1) und der Scavenger-Rezeptor SR-BI durchgeführt. Das Ungleichgewicht der Cholesterin Zustrom und Fluth in Makrophagen gilt ein Schlüsselprozess bei Arteriosklerose Einleitung6. Cholesterin-Efflux gilt als ein wichtiger Schritt in der Cholesterin-Beseitigung von peripheren Gewebe in das Plasma und Leber in einem Prozess namens reverse Cholesterin-Transport (RCT). Cholesterin wird von Makrophagen hauptsächlich an Apolipoprotein A1 (ApoA1) gefunden auf der Oberfläche des High-density-Lipoprotein (HDL) Teilchen übertragen. HDLs transportieren dann Cholesterin zur Leber für die Ausscheidung und Verwertung7,8,9.
Traditionell hat Tritium (3H) radioaktiv markierten Cholesterin Cholesterin Efflux10eingesetzt. Die Emission Signal von Radioisotopen ist hochempfindlichen10; Allerdings stellt die radioaktiv markierten Cholesterin offensichtliche Nachteilen wie lange Protokolle, Risiko einer Exposition gegenüber ionisierender Strahlung und die Notwendigkeit für spezielle Radioaktivität Einrichtungen und Anlagen zum sicheren Umgang mit radioaktiven Emissionen zu gewährleisten. Fluoreszenz ist hingegen erfolgreich in diagnostischen Techniken aufgrund seiner Einfachheit in fluoreszierenden Signalerkennung, die unterschiedlichsten Fluorophore verfügbar und seine Sicherheit11aufgenommen worden. Mehrere Leuchtstofflampen gekennzeichnet Sterole wurden verwendet, um Cholesterin-Stoffwechsel einschließlich Dehydroergosterol (mit intrinsische Fluoreszenz), Dansyl Cholesterin, 4,4-Difluoro-3a, 4adiaza-s-Indacene (BODIPY) studieren - Cholesterin und 22-(N) (7) Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-Cholesterin). Insbesondere stellt NBD-Cholesterin eine effiziente Aufnahme in menschlichen Zellen12. Derzeit gibt es zwei verschiedene NBD gekennzeichnet-Cholesterin: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) und 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; ( Abbildung 1). Cholesterin mit 22-NBD glyko-gekennzeichnet kann Cholesterin-Efflux-Studien, am besten passen, während 25-NBD-Cholesterin hauptsächlich in Zellmembran Dynamik Forschung13,14verwendet wird.
Zell-Linien in der Regel verwendet in in-vitro-Cholesterin-Efflux-Assays sind Monocyte-wie Zellen wie menschliche Leukämie abgeleitet THP-1-Zellen, murine Raw 264,7 Zellen15oder J774.1. Alle diese Zellen differenzieren sich in Makrophagen in Vitro mit Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA), aber THP-1-derived Makrophagen (DmTHP-1) am besten widerspiegeln und imitieren die menschliche Makrophagen16.
In der vorliegenden Studie, wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende Hochdurchsatz-Methode auf, um die Cholesterin-Efflux-Kapazität der Serumproben auf DmTHP-1, ermitteln mit 22-NBD-Cholesterin als Alternative zu [3H]-Cholesterin. Darüber hinaus vergleichen wir die optimierte fluoreszierende Technik mit dem standard radioaktiven analogen.
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Protocol
Für diese Studie wurden Ethikkommission Genehmigung (Comitè Ètic d' Investigacio Clínica, Klinik, Barcelona, Zulassungsnummer HCB/2014/0756) und schriftliche, informierte Zustimmung aller Fachrichtungen erhalten.
(1) NBD-Cholesterin Vorbereitung
- Auflösen der NBD-Cholesterin (MW 494.63; siehe Tabelle of Materials) in reinem Ethanol um das Lager (2 mM) zu erhalten. Lösen Sie für eine 10 mg Ampulle die gesamte Fläschchen Inhalte in einem 10,1 mL Volumen von Ethanol, ein 2 mM Lager zu erhalten auf.
- Verdünnen Sie die NBD-Cholesterin aus dem Bestand RPMI 1640 mit 10 % fetalen bovine Serum und 5 % Penicillin/Streptomycin (R10 Medium) ergänzt um eine Endkonzentration von 5 μM zu erreichen (z. B., erhalten 10 mL NBD-Cholesterin bei 5 μM Endkonzentration) durch verdünnen 25 μL der NBD-Cholesterin (2 mM) vorrätig R10 Medium. Diese Menge reicht für eine 96-Well-Platte.
2. Handy-Kultur und Seeding (2.Tag)
- Kultur-THP-1-Zellen in R10-Medium bei 37 ° C, 5 % CO2. Passen Sie auf 0,3 x 106 Zellen/mL alle 3 Tage.
- Samen der Zellen in einem weißen 96-Well-Platte mit einem flachen, klaren Boden bei 0,2 x 106 Zellen/Well in R10 Medium (100 μL pro Well).
- Behandlung der Zellen mit 100 nM Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA; aus einem Bestand von 10 μM) für 48-72 h, Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 THP-1 zu unterscheiden Zellen in DmTHP-1.
Hinweis: Es wird empfohlen, 5 μL der PMA Lager (10 μM) verwenden in 500 μL der R10 Medium. Davor bereiten Sie eine 10 μM PMA Lager durch Auflösen einer Durchstechflasche lyophilisierten 1 g in 10 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO), aliquoten und Lager bei-20 ° C. - Alternativ (Vorschlag) kombinieren Schritte 2.2 und 2.3 für besseren Homogenisierung. Bereiten Sie 10 mL THP-1-Zellen in der 15 mL Tube vor, fügen Sie 200 μL der PMA Lager (10 μM), mischen Sie vorsichtig und sofort Samen Sie 100 μL pro Well auf den Teller. Inkubieren Sie die Zellen, wie unter Punkt 2.3 beschrieben.
(3) Apolipoprotein B erschöpft Serum (ABDS) Vorbereitung (Tag 2 oder 3)
- Zur Vorbereitung einer Polyethylenglykol (PEG) Lösung verdünnen Sie Glycin in 10 % PBS (mit sterilen H2O) zu einer Konzentration von 200 mM bei pH 7,4. 40 mL 200 mM Glycin hinzufügen 10 g PEG 8000 PEG erhalten 20 % (w/V). Mischen Sie die Lösung kräftig zu homogenisieren.
- Gelten 4 Teile von 20 % pro 10 Teile von Serum/Plasma auf jede Serum/Plasma-Probe in einer 1,5 mL Tube PEG und lassen Sie die Mischung auf dem Eis für 25 min17 (z. B. für 100 μL Plasma oder Serum, fügen Sie 40 μL 20 % PEG Lösung).
- Zentrifugieren des PEG-Apolipoprotein B Niederschlags bei 13.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
- Verwerfen Sie den Niederschlag. Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Schlauch.
Hinweis: Wir empfehlen Ihnen, Vorbereitung der ABDS am Tag 3 (frisch). Wenn es nicht möglich ist, bereiten Sie die ABDS am 2. Tag und halten Sie es über Nacht bei 4 ° C.
4. NBD-Cholesterin Zelle laden (Tag 2)
- Entsorgen Sie das Kulturmedium des DmTHP-1 und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Die Wägezellen mit 5 μM NBD-Cholesterin (100 μL pro Well) in R10 Medium und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.
(5) Inkubation mit Cholesterin Akzeptoren (Tag 3)
- Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
- Inkubieren Sie die Zellen mit 2 – 5 % ABDS oder die gewünschte Konzentration von gereinigten Lipid-Akzeptor (HDL, ApoA, ApoE, etc.) verdünnt in farblos RPMI 1640 Medium (100 μL pro Well) für 4 – 6 h bei 37 ° c
Hinweis: Enthalten Sie eine Negativkontrolle (c-) bestehend aus farblos RPMI 1640 Medium ohne Akzeptoren und eine Positivkontrolle (C +) (z. B. ABDS aus einem Pool von gesunden Spendern) oder gereinigte HDLs. Beachten Sie, dass die Positivkontrolle gilt, vor allem wenn Patientenproben (Erkrankungen) analysiert (ergänzende Abbildung1). - Bereiten Sie eine 200 mL Brühe der Zelle Lysis Lösung 1 (50 mM Tris-Puffer, 150 mM NaCl, H2O). Mischen Sie die Zelle Lysis Lösung 1 bei 1:1 (V: V) Verhältnis mit reinem Ethanol die Lyse Lösung 2 zu erhalten.
(6) fluoreszierendes Signal zu erfassen (Tag 3)
-
Medien-NBD-Cholesterin-Erkennung
- Die Zelle Medium von den Platten zu entfernen und in eine neue weiße 96-Well-Platte mit einer undurchsichtigen flachen Boden zu sammeln.
- Fügen Sie für eine optimale Fluoreszenz Signalerkennung in den Medien Proben 100 μL von reinem Ethanol 100 μL jeder mittlere Probe auf ein 1:1 Verhältnis in der weißen 96-Well-Platte zu erhalten hinzu.
- Halten Sie der Platte mit den behandelten Medien weitere Maßnahme der Fluoreszenzintensität (FI) bei einer 463⁄536 nm (Anregung/Emission) Wellenlänge in die Luminometer.
-
Intrazelluläre NBD-Cholesterin-Erkennung
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
- Um den intrazellulären Cholesterinspiegel zu erhalten, lösen Sie die Zellen durch Inkubation sie mit 100 μL pro Well-Lyse Lösung 2 und schütteln Sie die Platte bei Raumtemperatur (RT) für 25 min.
- Für eine optimale Fluoreszenz Signalerkennung in die Zelle lysate Proben, erfassen der Fluoreszenzintensität der Zelle Lysates in der gleichen weißen 96-Well-Platte mit klaren flachen Boden (die gleiche Platte in dem in Schritt 2.2 Zellen ausgesät wurden).
- 6.3 während der Einstellung des Empfindlichkeit Parameters auf 50 in der Software der Fluoreszenzintensität (FI) in der Luminometer messen (siehe Tabelle der Materialien).
7. die Ergebnisermittlung
- Drücken Sie die Cholesterin-Efflux-Rate einer Probe als Prozentsatz berechnet, indem die Formel aus:
- Erhalten Sie das endgültige Maß der Cholesterin-Efflux (CE) durch Subtraktion der CE von der negativen Kontrolle (Beispiel mit NBD-Cholesterin geladen aber inkubiert mit farblosen RPMI 1640 Medium, ohne Cholesterin Akzeptoren) aus dem UZ der ein Muster gegeben:
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Representative Results
Der Cholesterin-Efflux-Test soll in Vitro die Cholesterin Efflux Kapazität eines bestimmten Serum, Plasma oder überstand mit HDL-Partikeln zu ermitteln. Die Methode besteht darin, be-gekennzeichnet Cholesterin in eine Kultur einer standard Makrophagen-Zelllinie und Kontakt mit der Teststichprobe verdünnt in FBS-freie Medien mit den Zellen induzieren. Schließlich sind die fluoreszierenden Werte aus der NBD in den Medien und Zelle lysate gemessen. Um die Messungen zu optimieren, wird das Effluxed Cholesterin aus den Zellen zu Medien mit einem Volumen von Lösungsmittel, enthält Ethanol vermischt. Die NBD-Cholesterin in den Zellen übrig ist in einem Lösungsmittel Ethanol oder Reinigungsmittel vor Messungen mit Nukleinsäuretablette. Zu guter Letzt wird das Verhältnis von gekennzeichnet Effluxed/Gesamt-Cholesterin bestimmt. Um die Technik einzurichten, wurde Apolipoprotein B-abgereicherte Serum (ABDS) aus einem Pool von gesunden Spendern verwendet.
Die besten Verdünnung-Voraussetzungen für die NBD-Cholesterin in Medium und Ethanol untersucht. Wir testeten das fluoreszierende Verhalten der freien NBD-Cholesterin Lösungsmittel Arbeitsbereichen, einschließlich der verschiedene Übersetzungen von Ethanol und farblos RPMI 1640. Der Fluoreszenzintensität (FI) der NBD-Cholesterin in die wässrige Lösung verdünnt zeigte die niedrigsten Werte FI, während NBD-Cholesterin innerhalb von reinem Ethanol die höchsten FI emittiert. Dies deutet darauf hin, dass die Fluoreszenz-Emission des 22-NBD-Cholesterin-Moleküls stark abhängig von dem Medium ist in dem es enthalten ist. Dementsprechend ist das Fluoreszenzsignal des 22-NBD-Cholesterins deutlich höher als in einem Ethanol mit Medien. Wir beobachteten, dass bei einem Verhältnis von 1:1 Medien: Ethanol, die Fluoreszenz-Intensität-Signal proportional mit der Konzentration des Cholesterins im Bereich von 0,5 bis 50 μM, was in diesem Fall auf ein angemessenes Verhalten der Sonde analog (Abbildung 2 erhöht ). Das lineare Verhalten im Zustand 1:1 (Medien: Ethanol) wird dargestellt, mit der folgenden Gleichung: y = 20,88 X + 146,7 mit R2 = 0.9341.
Ein wichtiger Schritt in dieser Methode ist die Zeit, die geladenen Zellen mit Cholesterin Akzeptoren Bebrüten, so ist das Cholesterin in der Lage, Ausfluss. Für die Ermittlung der erforderlichen Inkubationszeit geerntet wurde Zelle Medien an verschiedenen Zeitpunkten (1 bis 24 h; ( Abbildung 3). Die Cholesterin-Efflux im Bereich von 0 bis 6 h entwickelt linear (p < 0,0001; y = 18,2 X + 127,3) in einer Zeit-abhängigen Weise. Das maximale Signal erfasst wurde um 6 Uhr nach ABDS wurde hinzugefügt, um Zellen. Nach 6 h verlor das Cholesterin Regelmäßigkeit in die Fluth so Variabilität nach 6 h Inkubation mit ABDS (Abbildung 3 erhöhte).
Wir zusätzlich die Schwelle der Sättigung und Dynamik wie getestet auf menschlichen ABDS durch Messen der CE auf unterschiedliche Prozentsätze der HDL-haltigen Medien (ABDS) angewendet. Die NBD-Cholesterin Ausfluss im Hochdurchsatz-Assay (96-Well-Platte) entwickelte sich linear innerhalb von 1 – 7 % ABDS, wo FI in einer Konzentration-abhängigen Weise mit ABDS, erreicht die Spitze der Cholesterin-Efflux-Kapazität bei 7 % ABDS (Abbildung 4) erhöht. Bei Konzentrationen höher als 7 % zurückgegangen FI in eine inverse Beziehung mit dem ABDS Prozentsatz. Dies kann aufgetreten sein, weil das Cholesterin Wiedereinstieg war, dass die Zellen aus der NBD-Cholesterin HDL präsent in den Medien geladen.
Die standard-Methode zur Messung von Cholesterin Efflux verwendet Radio beschriftet (3H) Cholesterin16. Um die Leistung unserer Fluoreszenz basierende Methode, wir durchgeführt und fluoreszierende und Radio-Label Techniken verglichen. Wir fanden, dass die traditionellen Radioaktivität-Technik und unsere NBD-Cholesterin hoch korreliert waren (Pearsons R = 0,97; p < 0,001) mit verschiedenen Konzentrationen von ABDS (1 – 8 %; ( Abbildung 5). Insgesamt bedeutet dies, dass unsere fluoreszierenden Methode sicherer Ersatz als die radioaktive Technik sein kann.
Schließlich, verglichen wir unsere Methode, fluoreszierende Sonde anders als am nächsten Arbeitstag. Wir verglichen unsere Methode zu einem kommerziellen Hochdurchsatz-zellbasierte Assay Kit zielte darauf ab, die Cholesterin-Efflux in Zellen zu bestimmen (Cholesterin-Efflux-Assay-Kit; Zell-basierte(). In unserer Gruppe entwickelte Methode war empfänglich für eine Erhöhung der Akzeptor Konzentration (% ABDS) innerhalb CE Werte zwischen 5 und 15 %. Das kommerzielle Kit, durchgeführt nach den Anweisungen des Herstellers, führte jedoch CE Maßnahmen unter 5 % entlang der Reihe ABDS untersucht; so, die sich daraus ergebenden CE war im Wesentlichen unberührt als ABDS wurde erhöht (Abbildung 6).
Abbildung 1: Molekularstrukturen der natürliche Cholesterin (A), 22-NBD-Cholesterin (B) und 25-NBD-Cholesterin (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: NBD-Cholesterin Fluoreszenzintensität (FI) mit unterschiedlichen Seitenverhältnissen von Ethanol und farblos RPMI 1640 Medium. NBD-Cholesterin wurde verdünnt 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 und 0:1 Ethanol: wässrige mittlere Verhältnisse bei NBD-Cholesterin-Konzentrationen von 0,5 bis 50 µM. FI signal wurde durch die Luminometer mit der Empfindlichkeit Parametersatz mit 70 in der Fluorimeter-Software erkannt. Die FI-Signal der Medien und der Zelle lysate wurde mit weißen 96-Well-Platten gemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Zeit-Progression NBD-Cholesterin Ausfluss in Makrophagen THP-1 abgeleitet. DmTHP-1 waren beladen mit 5 µM NBD-Cholesterin und mit 5 % ABDS inkubiert. Zelle Medien wurden in einem weißen 96-Well-Platte an verschiedenen Zeitpunkten (1-24 h) gemessen. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung von vierfacher Brunnen präsentiert. FI-Signal wurde von der Luminometer mit der Empfindlichkeit Parametersatz mit 70 in der Fluorimeter-Software erkannt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: NBD-Cholesterin Ausfluss in THP-1-derived Makrophagen in 96-Well-Platte mit verschiedenen Konzentrationen von ABDS. Die DmTHP-1-Zellen wurden behandelt mit 5 µM NBD-Cholesterin, mit unterschiedlichen Anteilen von ABDS inkubiert und lysiert mit Ethanol. FI-Signal der Medien und der Zelle lysate wurde mit einer weißen 96-Well-Platte im Fluorimeter bei 1:1 (Ethanol: Lyse Lösung 1) gemessen. Die Maßnahmen der Negativkontrollen (ABDS unbehandelten Medien) wurden auf den Ebenen zur Verfügung gestellt abgezogen. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung von dreifacher Brunnen präsentiert. FI-Signal wurde von der Luminometer wobei der Parameter Empfindlichkeit bei 50 in der Fluorimeter-Software erkannt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Korrelation von NBD-Cholesterin und [3H]-Cholesterin Ausfluss in Makrophagen THP-1 abgeleitet. Folgende DmTHP-1 mit der entsprechenden gekennzeichnet-Cholesterin für 6 h. Die Cholesterin-Efflux wurde mit 1 bis 8 % ABDS gemessen. Für NBD-Cholesterin Proben war das Fluoreszenzsignal mit weißen 96-Well-Platten in der Fluorimeter bei 1:1 Ethanol: Lyse Lösung 1 nachgewiesen. FI-Signal wurde von der Luminometer wobei der Parameter Empfindlichkeit bei 50 in der Fluorimeter-Software erkannt. Für [3H]-Cholesterin Proben, das radioaktive Signal wurde mit 100 µL Medium erkannt und Zelle lysate, gemischt mit dem Funkeln cocktail und rot in der Szintillationszähler, nach dem Protokoll von Low Et Al.17. beschrieben Korrelation Effizienz wurde unter Verwendung Pearsons R Korrelationskoeffizient bestimmt. Die Maßnahmen der Negativkontrollen (ABDS unbehandelten Medien) wurden von Fluoreszenz und radioaktiven Ebenen zur Verfügung gestellt abgezogen. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung von dreifacher Brunnen präsentiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Vergleich zwischen Hochdurchsatz-NBD-Cholesterin-Efflux-Assay und kommerzialisierten fluoreszierende zellbasierte Assays Kit. Cholesterin-Efflux von ABDS wurde bewertet nach dem beschriebenen Protokoll, Verwendung als Lyse Lösungsmittel Ethanol (50 %) oder Tween 80 (1 %). Das fluoreszierende zellbasierte Assay Kit wurde laut Protokoll des Herstellers im Kit bewertet. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung von dreifacher Brunnen präsentiert. FI-Signal wurde durch die Luminometer erkannt, wobei der Parameter Empfindlichkeit bei 50 in der Fluorimeter Software Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Workflow-Diagramm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung1: NBD-Cholesterin Efflux von Serumproben von HIV-infizierten Patienten und standard Positivkontrolle (C +). Die interindividuelle Variation der NBD-Cholesterin Efflux-Methode auf eine Reihe von HIV-infizierten Patienten angewendet wird angezeigt. Eine interne Positivkontrolle (C +) stellt de NBD-Cholesterin Ausfluss aus einem Pool von Sera Proben von 8 gesunden Patienten. Fehlerbalken zeigen Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Leuchtstoff-gekennzeichnete Cholesterin ist eine vielversprechende Strategie analysieren und untersuchen die Eigenschaften und den Stoffwechsel von in-vitro-natürliche Cholesterin. Die wichtigsten Vorteile sind, dass es von den Zellen aufgenommen werden kann, ermöglicht die intrazellulären und Membran Reichweitenstudien und können auch auf Cholesterin Efflux-Assays wie in diesem Protokoll (Abbildung 7). Einige Leuchtstofflampen gekennzeichnet Sterole ermöglichen Cholesterin tracking in-vitro-einschließlich BODIPY-Cholesterin, Dansyl-Cholesterin, Dehydroegrosterol und 22 und 25-NBD-Cholesterin12. 22-NBD-Cholesterin eignet sich insbesondere für Untersuchung Cholesterin Dynamik mit verschiedenen Zelltypen und als Ersatz von Radio-Label Cholesterin18. Es gibt keine Konsensmethode, das Fluoreszenzsignal in einem Cholesterin-Efflux-Assay zu bewerten. Song Et Al.14 geerntet Medium und Zelle Lysates FI messen separat; Liu Et Al.14 das Medium auf anderen Platten übertragen, und die intrazelluläre Fluoreszenzsignal wurde gemessen, direkt in der Kultur-Platte; und Zhang Et Al.15 einen Lyse-Puffer zur lyse der Zellen, gefolgt von Reinigung des fluoreszierenden Cholesterins in reinem Ethanol verdünnen und die Fluoreszenz Intensität Signal19zu erkennen. In unseren Cholesterin-Efflux-Assay der gleichen Lösungsmittel Zusammensetzung in den Medien und Zellen erlaubt die Homogenisierung der Zelle Medien und Messungen der lysate effizient nutzen.
Die vorliegende Studie profiliert die NBD-Cholesterin-Efflux im Laufe der Zeit und fand eine zeitabhängige Progression bis zu 6 h Inkubation mit dem Akzeptor ABDS, ähnlich wie Lied Et Al.14 und Liu Et Al.14 und im Gegensatz zu Zhang Et Al., die eine 1 h Inkubationszeit verwendet mit der Lipid-Akzeptoren19. Wir fanden, dass nach 6 h Inkubation, das Effluxed Cholesterin Linearität verloren; Daher ist es vorrangig nicht um 6 h nicht überschreiten. Unsere optimale Cholesterin Ausfluss war zwischen 3 bis 6 h nach dem Hinzufügen der Akzeptoren. Wir empfehlen Ihnen, Inkubation der Zellen für 4 h mit dem Cholesterin-Akzeptoren. Weitere wichtige Schritte sind die farblosen Mediennutzung der Akzeptoren anwenden, um Hintergrund, eine semi-konfluierende Zellschicht Kultur Aussaat und Sicherstellung einer korrekten Einhaltung derer, die die Platte zu vermeiden. Es sei darauf hingewiesen, dass klare unten die weiße Platte nützlich ist, um die Zellen unter einem inversen Lichtmikroskop zu folgen.
Die meisten Cholesterin-Efflux-Assays sind mit gereinigtem Lipid Akzeptoren in der Cholesterin-Efflux-Test durchgeführt. Die gegenwärtige Technik wurde entwickelt, um die Cholesterin-Efflux-Kapazität von humanem Serum oder Plasma-Proben zu erhalten. Wir verwenden die intrinsische Cholesterin Akzeptoren im Serum vorhanden, aber es ist entscheidend für die Partikel mit Apolipoprotein B, die die Cholesterin-Moleküle innerhalb der Zellen20,21umwälzen würde zu entfernen. Als Modifikationen werden gereinigtes ApoAI und HDL dient auch als Akzeptoren. Auch Zelllinien als menschliche THP-1 in fluoreszierenden Cholesterin Efflux-Assays, wie Raw 264,7 oder J774A1 Makrophagen erfolgreich benutzt worden und wäre somit wahrscheinlich Arbeit in unserer Methode15,22.
Die wichtigsten Einschränkungen dieser Methode ist, dass Ergebnisse hängen von der spezifischen Zell-Linie, eine standard-Zelllinie zellfreie Methode wäre vorteilhaft, als Biomarker zu verwenden. Darüber hinaus wurde der Sera verwendet, um diese Methode zu standardisieren eingefroren; NBD glyko-auf Cholesterin ist weniger als das Radio-mit der Bezeichnung physiologisch, und seine Aufnahme unterscheidet das endogene Cholesterin; und wir testeten das Endergebnis eine Reihe von Prozessen (, mit Serum Partikel, eine Zelllinie, mögliche Veresterung des Cholesterins, mögliche Verbreitung von Cholesterin oder Ausfluss und Zustrom Prozesse gleichzeitig). Als Vorteil, Fluoreszenz-basierte Techniken haben jedoch gezeigt, haben hohes Potential als Ersatz für traditionelle radioaktiv markierten Techniken und in der Substitution von [3H]-Cholesterin durch eine fluoreszierende gekennzeichnet Molekül zu überwachen Cholesterin-Efflux assays14.
Cholesterin-Efflux kann als Biomarker der Atherosklerose23, handeln, wie es mit zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse24,25 korreliert. Eine Möglichkeit zur Untersuchung der Rolle von Makrophagen in Atherosklerose ist durch gereinigte HDLs und seine Zusammensetzung; HDLs Reinigung ist jedoch eine mühsame und zeitraubende Prozess. Außerdem, während der Reinigung, andere Serumkomponenten mit atherogenen Effekt können unterschätzt werden oder verloren gehen. Aus diesem Grund wurde die Lipid-Akzeptor ABDS gewählt. Hochdurchsatz-Skala und Zeitverkürzung wurden ermöglicht durch Substitution der Szintillationszähler für einen Teller-Leser, messen das Fluoreszenzsignal in der gleichen Kultur-Platte (im Falle der Zelle lysate) und das Protokoll um zwei Tage zu reduzieren. Darüber hinaus zeigt diese Technik höheren Empfindlichkeit, wenn Zellen unterschiedliche Konzentrationen von Serum als die Maßnahmen, die aus einem kommerzialisierten Bausatz Cholesterin Ausfluss beurteilen ausgesetzt sind.
Abschließend wurde ein NBD-Cholesterin-Efflux-Assay mit der traditionellen radioaktiven Methode korreliert beschrieben. Wir bestimmt die optimale Zeit zu inkubieren Sie Lipid Akzeptoren aus humanen Proben (Serum oder Plasma) in Form von ABDS. Wir haben Zelle Aussaat, Differenzierung, Dynamikbereich und Sättigungspunkt der Technik optimiert. Für seine wichtigste Neuerung haben wir eine Lösungsmittel Kombination verwendet bei Messungen für den Erhalt der hohen Intensitäten und eine verbesserte linearen Bereich optimiert.
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Disclosures
Möchten die Autoren erklären, dass sie Erfinder der Patentanmeldung (EPA, 18382337.6-1118, 17. Mai 2018) mit dem Titel "Methode für die Bestimmung von Cholesterin Efflux" basiert auf diese Methode.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise von unterstützt die Forschung gewährt FIS (PS12/00866) vom Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien; Fondo Europeo Para el Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación En SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) und CERCA Programm / Generalitat de Catalunya. Die Autoren danken den Retrovirology und virale Immunpathologie Labor des Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Wir danken T. Escribà, C. Rovira und C. Hurtado für ihre Unterstützung und S. Cufí vom Wissen und der Technologie-Transfer-Büro für ihre Führung in der Erfindung zu schützen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A.
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
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