Остеокласты представляют собой тканеспецифические макрофаги, полученные из моноцитов-макрофагов линии гемопоэтических стволовых клеток. Этот протокол описывает, как изолировать клетки костного мозга, чтобы получить большое количество остеокластов при одновременном снижении риска несчастных случаев, найденных в традиционных методах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция, очищение, и дифференциация Остеокласт прекурсоров из костного мозга крысы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Остеокласты большие, многоядерные, и кости-расрезные клетки моноцитов-макрофагов линии, которые формируются путем слияния моноцитов или прекурсоров макрофагов. Чрезмерное резорбция кости является одним из наиболее значимых клеточных механизмов, ведущих к остеолитических заболеваний, включая остеопороз, периодонтит, и перипротеза остеомолиза. Основной физиологической функцией остеокластов является поглощение как гидроксиапатитового минерального компонента, так и органической матрицы костной ткани, генерирующей характерный вид резорбции на поверхности костей. Есть относительно мало остеокластов по сравнению с другими клетками в организме, особенно у взрослых костей. Недавние исследования были посвящены тому, как получить более зрелые остеокласты за меньшее время, что всегда было проблемой. В лабораториях в целях получения более зрелых остеокластов были разработаны некоторые усовершенствования в методах изоляции и культуры. Здесь мы вводим метод, который изолирует костный мозг за меньшее время и с меньшими усилиями по сравнению с традиционной процедурой, используя специальное и простое устройство. С использованием градиента центрифугирования плотности, мы получаем большое количество полностью дифференцированных остеокластов из крысиного костного мозга, которые определены классическими методами.
Введение
Костный гомеостаз – это сложный физиологический процесс, регулируемый остеокластами костной ткани и образующие костные остеобласты1. Равновесие между остеобластным и остеокластов активностью при посредничестве остеобластов и остеокластов, соответственно, крайне важно для поддержания здоровья костей и гомеостаза, поскольку возмущения в костном гомеостазе могут приводить к заболеваниям костей, таким как аномальный рост костей или потеря плотности костной ткани. Как уникальные кости-резорбции, остеокласты имеют важное значение при заболеваниях, связанных с аномальной костной разрушения, включая остеопороз, периодонтит, и перипротеза остеолиза
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, связанные с животными, описанным здесь, одобрены институциональным Комитетом по уходу и использованию животных (ИАКУК) Нанкинского университета китайской медицины.
1. Настройка
- Подготовьте несколько продольно срезанные 1 мл пипетки (1 см) и несколько 1,5 мл микроцентрифуг. Положите пипетки советы и микроцентрифуги на 103 КНА и 121 ° c для 20 мин и убедитесь, что они стерильны.
- Приготовьте коробку со льдом и несколько стерильных тарелок, чтобы сохранить изолированные ткани во время процедуры изоляции.
2. Подготовка культурной среды
- Подготовьте полную среду культуры. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Цель протокола заключалась в том, чтобы удобно изолировать и очищать большое количество прекурсоров остеокластов и успешно вызывать остеокласты. Дополняя M-СМЖ и RANKL, гигантские остеокласты были замечены в дни 5-6. Формирование остеокластов было успешно идентифицировано пятнать ловушки (рис. 1A). Большие и фиолетовые клетки рассматривались как ловушки-позитивные клетки с несколькими ядрами (обычно три ядра). С помощью этого метода, это было типично для полу.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Способность получать и изучать остеокласты в пробирке является критическим и фундаментальным навыком для любого исследователя, желающего изучать костный метаболизм, что может помочь понять механизмы костной поглощающей болезни и развить новые терапевтические агенты. В настоящем исследовании описан протокол с некоторыми изменениями на основе предыдущих методов.
Используя пипетки и микроцентрифужные трубки для получения костного мозга, это в значительной степени уменьшило время работы по получен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81473692) к Юн мА. Авторы благодарят весь коллектив медицинского исследовательского центра первого колледжа клинической медицины в Нанкинском университете китайской медицины.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Кислая фосфатаза, лекоциты (TRAP) набор | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Автоматический слайсер твердых тканей | Lecia | RM2265 | |
| Бедренная кость | Приобретенные нами | ||
| Клеточный инкубатор | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Козья анти-кроличья IgG H& L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Измельчители твердых тканей | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Силикатная центробежная трубка и раствор для разделения клеток |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Инвертированный фазово-контрастный микроскоп | Olympus | CKX31 | |
| Инвертированный флуоресцентный микроскоп | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, без глутамина | Gibco | 11090-081 | |
| Пенициллин-стрептомицин, жидкий | Gibco | 15140122 | |
| кролик Антикальцитониновый рецептор | Bioss | bs-0124R | |
| Рекомбинантная крыса M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Рекомбинантная крыса sRANK Лиганд | PeproTech | 400-30 | |
| Буфер для лизиса эритроцитов | Absin | abs47014932 | |
| Сканирующая электронная микроскопия | FEI | Quanta 200 | |
| Толуидин синий | Sigma-Aldrich | 89649 |
Ссылки
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12)....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
