Mesoskaligen Partikel Image Velocimetry Studien des neurovaskulären fließt In-vitro-
Summary
Hier präsentieren wir vereinfachte Methoden für die Herstellung von transparenten neurovaskuläre Phantome und Charakterisierung des Fluss darin. Wir markieren Sie mehrere wichtige Parameter und ihre Beziehung zum Feld Genauigkeit zu demonstrieren.
Abstract
Particle Image Velocimetry (PIV) dient in einer Vielzahl von Feldern, durch die Möglichkeit, die es für präzise Visualisierung und Quantifizierung fließt in einem großen raumzeitlichen Spektrum bietet. Ihre Umsetzung erfordert jedoch in der Regel die Verwendung von teuer und spezialisierte Instrumentierung, die seine breitere Dienstprogramm begrenzt. Darüber hinaus auf dem Gebiet der Biotechnologie, in-vitro- Flow Visualisierung Studien sind auch oft weitere begrenzt durch die hohen Kosten der kommerziell sourced Gewebe Phantome, die gewünschten anatomische Strukturen, vor allem für diejenigen zu rekapitulieren, die Das mesoskalige Regime (d.h. Submillimeter Millimeter Länge Skalen) erstrecken. Hier präsentieren wir Ihnen ein vereinfachte experimentelles Protokoll entwickelt, um diese Einschränkungen zu beheben, die Schlüsselelemente von denen umfassen (1) eine relativ kostengünstige Methode zur Herstellung von mesoskaligen Gewebe Phantome mit 3D-Druck und Silikon gießen, und (2) eine OpenSource-Bild Analyse und Verarbeitung Rahmen, der die Nachfrage nach Instrumenten zur Messung der mesoskaligen fließt reduziert (d.h., Geschwindigkeiten bis zu zehn Millimeter/Sekunde). Kollektiv, senkt dies die Einstiegsschwelle für unverständliche, durch die Nutzung von Ressourcen bereits zur Verfügung stehen viele Bioengineering Forscher. Wir Demonstratethe Anwendbarkeit dieses Protokolls im Rahmen des neurovaskulären Fluss Charakterisierung; Allerdings wird es voraussichtlich für ein breiteres Anwendungsspektrum mesoskalige in Bioingenieurwesen und darüber hinaus relevant sein.
Introduction
PIV ist weit verbreitet in Experimentelle Strömungsmechanik für Visualisierung und quantitative Untersuchungen der fließenden Bewegung, die in Längenskala von atmosphärischen mikrozirkulatorischen fließt1,2,3variieren. Während die Besonderheiten ihrer Umsetzung so weit wie ihre Anwendungen variieren können, ist ein Aspekt für fast alle PIV Studien die Verwendung von video-Bildgebung der Tracer Partikel innerhalb des Arbeitsfluids, gefolgt von einer paarweisen Analyse der aufeinander folgenden Bildrahmen ausgesät gewünschten Fließeigenschaften zu extrahieren. In der Regel erfolgt dies durch erste Unterteilung jeder Bildrahmen in kleinere Regionen Verhör Windows bezeichnet. Als Folge der zufälligen Positionen der dispergierten Partikel enthält jedes Verhör-Fenster eine eindeutige Verteilung der Pixelintensität. Wenn die Fenster-Dateigröße und Datenrate Erwerb passend gewählt sind, kann Kreuzkorrelation des Signals Intensität in jedem Fenster verwendet werden, um die durchschnittliche Verschiebung innerhalb der Region zu schätzen. Schließlich, angesichts der Tatsache, dass die Vergrößerung und die Frame-Rate experimentellen Parameter bekannt sind, kann eine momentane Geschwindigkeit Vektor auffangen leicht berechnet werden.
Ein großer Vorteil der PIV über Einzelpunkt-Messverfahren ist seine Fähigkeit Vektorfelder auf einer zwei- oder dreidimensionalen Domäne zuordnen. Hämodynamische Anwendungen profitierten vor allem von diese Funktion, denn es eine gründliche Untersuchung der lokalen Strömungen, die bekannt sind ermöglicht, spielen eine wichtige Rolle bei Gefäßerkrankungen oder Umbau (z.B., Atherosklerose, Angiogenese) 4 , 5 , 6. Dies wurde auch für die Bewertung der neurovaskulären fließt wahr, und deren Wechselwirkungen mit Endovaskuläre Prothesen (z.B., Flow Diverter, Stents, intrasaccular Spulen), da die relevanten Längenskalen in solchen Anwendungen können häufig umfassen eine oder mehrere Größenordnungen (z.B.von Mikrometer auf Millimeter) und Gerät Geometrie und Platzierung kann die lokale Strömungsmechanik7erheblich beeinträchtigen.
Die meisten Gruppen PIV-basierte hämodynamischen Untersuchungen Vertrauen auf Versuchsanordnungen, die einige der frühesten Untersuchungen des Stents Einfluss auf vaskuläre Flow7,8eng imitieren. Diese gehören in der Regel eine) gepulste Laser und High-Speed-Kameras erfassen hoher Geschwindigkeit fließt; (b) Synchronizer, Aliasing zwischen die Pulsfrequenz des Lasers und die Framerate der Kamera Übernahme zu verhindern; (c) zylindrische Optik, bilden einen leichten Bogen und so minimieren die Hintergrundfluoreszenz vom Tracer Partikel oberhalb und unterhalb der Ebene der Vernehmung; (d) bei der kommerziellen schlüsselfertige Systeme, proprietäre Software-Pakete, die Kreuzkorrelation Analysen durchzuführen. Aber, während einige Anwendungen erfordern die Leistung und/oder die Vielseitigkeit, die gemeinsam von diesen Komponenten gewährt, nicht viele andere. Darüber hinaus die hohe Kosten der kommerziell sourced Gewebe Phantome, die gewünschte vaskuläre Strukturen rekapitulieren können auch beweisen Begrenzung für viele in-vitro- Studien, insbesondere für die Phantome mit verfügt über die Brücke des mesoskaligen Regimes (> 500 USD / Phantom). Hier berichten wir über die Entwicklung eines vereinfachten Protokolls zur Umsetzung PIV für in-vitro- Visualisierung der neurovaskulären Ströme, die in der Regel sowohl räumlich liegen und zeitlich innerhalb des mesoskaligen Regimes (d.h.Längenskalen bis hin von Submillimeter Millimeter und Geschwindigkeiten bis zu zehn Millimeter/Sekunde). Das Protokoll soll Ressourcen bereits zur Verfügung stehen viele Bioengineering Forscher, wodurch die Einstiegsschwelle für unverständliche nutzen.
Das erste Element dieses Protokolls beinhaltet die Verwendung von einer Investition Gießtechnik, die hauseigene Herstellung von transparenten, Polydimethylsiloxan (PDMS) ermöglichen-basierte Gewebe Phantome aus 3-D-gedruckt Opfer Formen. Durch die Nutzung der zunehmenden Verfügbarkeit von 3-d-Drucker in den letzten Jahren, insbesondere in geteilt/multi-user Einrichtungen (z.B., institutionelle Einrichtungen oder öffentliche Makerspaces), diese Methode senkt die Kosten erheblich (z. B.< 100 USD/Phantom im hier vorgestellten Fall), und ermöglicht eine schnelle Trendwende für die Herstellung einer Vielzahl von Designs und Geometrien. In das aktuelle Protokoll ein fused Deposition Modellierung dient als Baustoff mit Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) und der gedruckten Teil dient als Opfer Form für das spätere phantom Casting. Unsere Erfahrung hat gezeigt, dass ABS eignet sich gut für einen solchen Einsatz, denn es löslich in gebräuchlichen Lösungsmitteln (z.B. Aceton ist), und es hat ausreichende Festigkeit und Steifigkeit zu Schimmel Integrität nach dem Entfernen des Trägermaterials (z.B., zu verhindern, dass die Verformung oder Bruch der Diminutiv Formelemente). Das aktuelle Protokoll ist Schimmel Integrität weiter gewährleistet mit gedruckten Volumenmodelle, obwohl dies auf Kosten der erhöhten Auflösungszeit kommt. Die Verwendung von hohlen Modellen kann auch in einigen Fällen, solvent Zugang zu verbessern und somit die Auflösungszeit möglich sein. Jedoch kann sorgfältige Beachtung geschenkt werden sollte, die Wirkung dies auf Schimmel Integrität haben. Schließlich, während die Phantoms hierin fabriziert auf idealisierte Darstellungen der neurovaskulären Strukturen erzeugt, mit einer gemeinsamen Computer aided Design (CAD) Software basieren, das Protokoll soll offen für die Herstellung von komplexen , Patienten-spezifischen Geometrien sowie (z.B. über die Verwendung von Modelldateien erzeugt durch die Umwandlung des klinischen Bilddaten, die. STL Datei-Format von den meisten 3-d-Druckern verwendet). Weitere Details zu den phantom Fertigungsprozess sind in Abschnitt 2 des Protokolls zur Verfügung gestellt.
Das zweite Element des Protokolls beinhaltet die Verwendung einer Open-Source-Plug-in für ImageJ die Kreuzkorrelation Analysen9durchzuführen. Dies ist in Verbindung mit der Umsetzung eines einfachen statistischen Schnittstellenüberwachung Systems (d.h.Intensität Deckelung)10 , das Bildsignal vor ein postcorrelation Vektor-Validierung-Schema, die normalisierte Kreuzkorrelation sowie zu verbessern Median-Test (NMT), unechte Vektoren durch einen Vergleich der einzelnen auf seine nächsten Nachbarn11zu beseitigen. Gemeinsam können bildgebende Geräte weit verbreitet in vielen Laboratorien der Biotechnik, wodurch die Notwendigkeit für den Erwerb von viele teuren Komponenten typisch PIV-Systeme (z.B., gepulste Laser ausgeführt werden sollen Synchronizer, zylindrische Optik und proprietäre Software). Weitere Details zur video-Sammlung, Bildverarbeitung und Analyse der Daten sind in den Abschnitten 5 und 6 des Protokolls zur Verfügung gestellt.
Abbildung 1 zeigt das PIV-Setup verwendet in diesem Protokoll stützt sich auf ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Hochgeschwindigkeitskamera für imaging, sowie eine externe, kontinuierliche Weißlichtquelle (d.h., Metalldampflampen) ausgestattet für volumetrische Beleuchtung durch Ziel. Eine variabler Drehzahl Zahnradpumpe wird verwendet, um den umlaufenden Fluss einer transparenten mock Blut-Lösung durch die neurovaskuläre Gewebe Phantome zu verhängen. Die Lösung besteht aus einer 60: 40 Mischung von entionisiertem Wasser (DI) und Glycerin, die gemeinsame Ersatz für Blut im hämodynamischen12,13,14, durch Studien eine) ähnliche Dichte und Viskosität (d.h., 1.080 kg/m3 und 3,5 cP vs. 1.050 kg/m3 und 3-5 cP für Blut)15,16; (b) seine Transparenz im sichtbaren Bereich; (c) seine ähnlichen Brechungsindex wie PDMS (1,38 vs. 1.42 für PDMS)17,18,19,20, die optischen Verzerrungen minimiert; (d) die Leichtigkeit, mit der nicht-newtonsches Verhalten kann, eingeführt werden, wenn nötig, über die Zugabe von Xanthane21. Schließlich sind fluoreszierende Polystyrol-Kügelchen als Tracer Partikel (10,3 µm im Durchmesser; 480 nm/501 nm Anregung/Emission) verwendet. Während neutral Auftrieb Perlen gewünscht werden, kann Beschaffung Tracer Partikel mit optimale mechanische Eigenschaften (z.B.Dichte, Größe, Zusammensetzung) und Emissionswellenlänge herausfordernde beweisen. Die hierin verwendeten Perlen sind beispielsweise etwas weniger dicht als die Glycerin-Lösung (1.050 kg/m3 vs. 1.080 kg/m3). Die hydrodynamische Effekte, davon sind jedoch vernachlässigbar, angesichts der Tatsache, dass die Dauer der ein typisches Experiment viel kürzer als die Zeitskala mit Auftrieb Wirkungen verbunden ist (d.h., 5 min und 20 min, beziehungsweise). Weiter sind Einzelheiten über die mock Blut Lösung Formulierung und in-vitro- Herz-Kreislauf-System Set-up in den Abschnitten 3 und 4 des Protokolls zur Verfügung gestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll beschriebenen Umrisse ein vereinfachtes Verfahren für die Durchführung von PIV Studien um neurovaskuläre visualisieren an physiologisch relevanten Dimensionen und Fluss Bedingungen in Vitromündet. Auf diese Weise dient es Ergänzung Protokolle von anderen berichtet, die auch konzentriert haben, über die Vereinfachung der Quantifizierung der Vektorfelder, sondern in sehr verschiedenen Kontexten, die erfordern, dass die Berücksichtigung der weit größeren Länge25 oder …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen teilweise Unterstützung für dieses Projekt zur Verfügung gestellt durch einen kooperativen Samen Zuschuss aus dem Office of Research und ökonomische Entwicklung an der UC Riverside.
Materials
| Solidworks 2015 | Dassault Systems | N/A | CAD Software |
| Dow Corning Sylgard 184 Kit | Ellsworth Adhesive | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | PDMS Kit |
| Stratasys Dimension Elite | Stratasys | 9180-00105 | 3D printer |
| P430 Model Material Cartridge | Stratasys | 340-21202 | ABS build material |
| P400 SR Soluble Support Material Cartridge | Stratasys | 340-30200 | Support material |
| CleanStation DT3 | PM3 Technologies | 00-00300R | Base bath |
| Lindberg Blue M LGO Box Furnace | Thermo Scientific | LB305745M | Oven |
| 21G BD PrecisionGlide Needle | Betcon Dickenson | BD 305167 | Branching perforator mold segment |
| Desiccator (Vacuum) | Polylab | 55205 | Desiccator |
| Branson 1800 Utrasonic Cleaning | Branson | CPX-952-116R | Sonicator |
| Acetone | Fisher Chemical | A9494 | Acetone |
| Isopropol Alcohol | Fisher Chemical | A4514 | Isopropol Alcohol |
| Glycerol | Fisher Chemical | GW33500 | Glycerol |
| 10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles | Magsphere | PSF-010UM | Fluorescent beads |
| Phantom Miro | Vision Research | Miro M310 | High speed camera |
| Micropump | Cole-Parmer | 81101 | Recirculating pump |
| Leica DM2000 | Leica Microsystems | DM2000 | Fluorescent Microscope |
| Leica 10X Objective | Leica Microsystems | 506259 | Objective for perforator |
| Leica 2.5X Objective | Leica Microsystems | 11506083 | Objective aneurysm sac |
| Leica Blue Filter Cube L5 | Leica Microsystems | 513840 | Blue filter cube |
| Leica EL6000 | Leica Microsystems | 11504115 | Light source |
| Alconox | Alconox Inc | 1104-1 | Detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | Open source image analysis software https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Particle Image Velocimetry PIV Plugin | Qingson Tseng | N/A | https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv |
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