El modelo de infección de Waxworm Galleria mellonella para la Candidiasis diseminada

Summary

Galleria mellonella sirve como un modelo de invertebrado para la candidiasis diseminada. Aquí detallamos la infección el protocolo y proporcionar datos de apoyo para la efectividad del modelo.

Abstract

Las especies de Candida son comensales hongos comunes de los seres humanos colonizando la piel, superficies mucosas y tracto gastrointestinal. Bajo ciertas condiciones, la Candida puede cubran sus nichos naturales dando por resultado debilitante mucosas infecciones como infecciones sistémicas así como peligrosa para la vida, que son un foco importante de la investigación debido a su alta mortalidad asociada. Modelos animales de infección diseminada existen para estudiar la progresión de la enfermedad y las características de patogenicidad de Candida de disección. De estos, el modelo de infección de waxworm Galleria mellonella proporciona una rentable herramienta experimental para investigaciones de alto rendimiento de virulencia sistémica. Muchos otros agentes infecciosos bacterianos y eucariotas han sido efectivamente estudiados en g. mellonella para entender patogenicidad, convirtiéndolo en un sistema modelo ampliamente aceptado. Sin embargo, variación en el método utilizado para infectar a g. mellonella puede alterar los resultados fenotípicos y complicar la interpretación de los resultados. Aquí describiremos las ventajas e inconvenientes del modelo waxworm estudiar patogenia de Candida sistémica y un enfoque para mejorar la reproducibilidad del detalle. Nuestros resultados destacan la gama de la cinética de mortalidad en g. mellonella y describen las variables que pueden modular la cinética de estos. En última instancia, este método se erige como un enfoque ético, rápido y rentable para el estudio de virulencia en un modelo de candidiasis diseminada.

Introduction

Las especies de Candida son comensales humanos comunes que son capaces de emerger como patógenos oportunistas en severamente inmunocomprometidos y pacientes disbiotica. Aunque muchas especies de Candida pueden causar enfermedad, C. albicans es la causa más frecuente de candidiasis diseminada^1,2. Enfermedad sistémica resulta de C. albicans de acceso a la circulación sanguínea a través de cualquier penetración directa de las barreras del huésped previamente restrictivas o introducción en sitios quirúrgicos y otros incumplimientos del cuerpo³. Las especies de Candida utilizan una gama de procesos patógenos para causar enfermedad sistémica en el host incluyendo filamentación, formación de biopelículas, evasión inmune celular, escape y plancha limpieza⁴. Existen enfoques in vitro para investigar los mecanismos patogénicos, pero modelos animales continúan proporcionando la mejor opción para investigar la totalidad de la enfermedad resultado^5,6. La investigación anterior ha detallado muchas instancias de prometedoras investigaciones en vitro de virulencia pudiendo reproducir en vivo^7,8. Por lo tanto, se requiere evaluar virulencia modelos animales en vivo. Más modelos de la enfermedad dependen de ratones para servir como un sustituto para las infecciones humanas a pesar de la incapacidad de C. albicans coloniza naturalmente sistemas murinos como un comensal⁹. Los modelos invertebrados de candidiasis diseminada incluyen el nematodo elegans de Caenorhabditis, la fruta la mosca Drosophila melanogastery waxworm Galleria mellonella, aunque preocupaciones acerca de las diferencias fundamentales en fisiología básica, las temperaturas del cuerpo anfitrión y las rutas de exposición han obstaculizado su amplia aceptación^10,11.

Más recientemente, se ha adoptado el modelo de infección de g. mellonella waxworm a patogenicidad de modelo de una amplia gama de bacterias y hongos patógenos^12,13,14. Ventajas de este modelo son su relativamente bajo costo, mayor rendimiento, facilitan de uso y reducción preocupaciones éticas sobre beneficencia animal comparado con modelos murinos. Para los investigadores, esto se traduce en mayor capacidad de prueba de múltiples variables, intervalos de confianza más fuerte, más rápida experimentación y derivación de protocolos animal. G. mellonella ha servido como una plataforma para evaluar rápidamente la virulencia de C. albicans después de perturbación de los genes necesarios para biofilm formación, filamentación y gene regulación a través de aislamientos clínicos de^{11,15 ,16}. Estudios recientes han incorporado la investigación de la eficacia antifúngica utilizando g. mellonella para evaluar la farmacocinética de la droga actividad y resistencia en vivo en configuración, que son otra manera desafiante y ^{mucho tiempo 17,18}. Sin embargo, estudios de virulencia de C. albicans en g. mellonella han sido complicados por presuntamente altos niveles de variación dentro de los experimentos y protocolos incompatibles entre grupos de investigación que producen distintos fenotipos de virulencia entre ratones y waxworms^{11,13,19,20,21}. Aquí, describimos un protocolo de g. mellonella para normalizar la reproducibilidad de aumento de infecciones, C. albicans en experimentos de virulencia y demostrar coherencia con estudios previamente descritos de virulencia en murine modelos.

Estudios previos demostraron que C. albicans (MTL) de tipo-como locus en el cromosoma 5 de acoplamiento regula célula identidad y competencia similar a Saccharomyces cerevisiae y otros ascomiceto hongos²²de apareamiento. La mayoría de los aislamientos de C. albicans es heterocigoto en el locus MTL , codificación de cada uno de los MTLuna y MTLα alelos (MTLun/α) y es por lo tanto estéril^{15, 23 , 24}. pérdida de uno de los alelos MTL por la pérdida del heterocigoto (LOH) o mutación conduce a homocigótica MTLuna o MTLα cepas que pueden experimentar un cambio fenotípico desde el estado estéril ‘blanco’ a la apareamiento de estado ‘opaco’ competente²⁵. Trabajo previo ha puesto de manifiesto que la pérdida de heterocigoto MTL reduce también virulencia en modelos murinos de infección sistémica por cepa diferente fondos²⁶. Aquí detallamos el modelo de g. mellonella para candidiasis diseminada con un conjunto experimental genéticamente similar para representar la contribución de MTL heterocigoto a la virulencia en g. mellonella. Mostramos que la configuración de MTL influenciada patogenicidad de C. albicans , donde MTLα fueron menos virulenta con respecto aun/α MTLy MTLa las células, similares a resultados en modelo murino infección²⁶.

Protocol

Todos los métodos descritos dependen del uso de hospedadores invertebrados y no requieren de aprobación institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC). 1. larvas de galleria mellonella Waxworm Larvas del orden de mayoristas y proveedores que no introducen hormonas, antibióticos u otros tratamientos para las larvas y que son capaces de enviar y entregar a especímenes vivos. Asegúrese de comprar todas las larvas del mismo proveedor durante el curso de la ex…

Representative Results

Aquí, demostramos un método reproducible para el uso de g. mellonella waxworms investigar un modelo de candidiasis diseminada de la infección con C. albicans. El adecuado almacenamiento, mantenimiento y selección de larvas para la infección son componente fundamental de asegurar reproducibilidad en g. mellonella mortalidad (figura 1A). Larvas sanas que son activas, tienen un color amarillo/tan claro, y parches …

Discussion

El modelo de g. mellonella waxworm se erige como una herramienta eficaz para el análisis rápido y reproducible de la virulencia de C. albicans . Este protocolo detallado se basa en una implementación consistente de una dosis infecciosa definida al mismo sitio a través de un lote de larvas. Dosis infecciosa tiene un profundo impacto sobre la mortalidad de g. mellonella mientras que uso de larvas entre su llegada inicial y diez días siguientes a la recepción produjo resultados similares. P?…

Materials

Galleria mellonella	Snackworms.com		Buy twice as many worms as expected to use
10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe	Hamilton	80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack	Fisher	FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack	VWR	87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL	VWR	97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL	Millipore Sigma	EM-EX0276-1S
autoclaved ddH2O