O modelo de infecção Waxworm Galleria mellonella para candidíase disseminada

Summary

Galleria mellonella serve como um modelo de invertebrados para candidíase disseminada. Aqui, detalhamos a infecção do protocolo e fornecer dados de apoio para a eficácia do modelo.

Abstract

Espécies de Candida são comensais fungos comuns dos seres humanos colonizando a pele, mucosas e trato gastrointestinal. Sob certas condições, a Candida pode overgrow seus nichos naturais resultando em debilitantes infecções da mucosa como infecções sistêmicas bem como risco de vida, que são um grande foco de investigação devido a seus associados altas taxas de mortalidade. Existem modelos animais de infecção disseminada para estudar a progressão da doença e dissecando as características de patogenicidade da Candida . Destes, o modelo de infecção waxworm Galleria mellonella fornece uma ferramenta de experimental cost-effective para investigações de alta produtividade de virulência sistêmica. Muitos outros agentes infecciosos bacterianos e eukaryotic têm sido efetivamente estudados em mellonella g. para entender a patogenicidade, tornando-se um sistema de modelo amplamente aceito. Ainda, variação no método usado para infectar mellonella g. pode alterar os resultados fenotípicos e complicar a interpretação dos resultados. Aqui, podemos descrever os benefícios e as desvantagens do modelo waxworm para estudar a patogênese de Candida sistêmica e uma abordagem para melhorar a reprodutibilidade de detalhe. Nossos resultados destacam a variedade de cinética de mortalidade em g. mellonella e descrevem as variáveis que podem modular esses cinética. Em última análise, este método permanece como uma abordagem ética, rápida e econômica para estudar a virulência em um modelo de candidíase disseminada.

Introduction

Espécies de Candida são comensais humanas comuns que são capazes de emergir como patógenos oportunistas em severamente imunocomprometidos e pacientes disbióticas. Embora muitas espécies de Candida podem causar doença, c. albicans é a causa mais prevalente de candidíase disseminada^1,2. Doença sistêmica resulta da c. albicans acessando na corrente sanguínea através de qualquer penetração directa das barreiras restritivas anteriormente anfitrião ou introdução em sítios cirúrgicos e outras violações do corpo³. Espécies de Candida utilizam uma variedade de processos patogênicos para causar doença sistêmica dentro do host, incluindo filamentação, formação de biofilmes, evasão de células imunes e fuga e ferro⁴de eliminação. Existem em vitro abordagens para investigar mecanismos patogénicos individuais, mas modelos animais continuam a fornecer a melhor opção para investigar a totalidade do resultado de doença^5,6. Pesquisas anteriores detalhou muitas instâncias do promissor em vitro investigações de virulência falhando reproduzir na vivo^7,8. Assim, modelos animais ainda são necessários para avaliar a virulência in vivo. A maioria dos modelos da doença dependem de ratos para servir como um substituto para infecções humanas apesar da incapacidade de c. albicans naturalmente colonizar sistemas murino como um comensal⁹. Modelos de invertebrados de candidíase disseminada incluem o nematódeo Caenorhabditis elegans, a fruta voa melanogaster da drosófilae o waxworm Galleria mellonella, embora as preocupações sobre diferenças fundamentais em fisiologia básica, a temperatura do corpo hospedeiro e rotas de exposição têm dificultado sua ampla aceitação^10,11.

Mais recentemente, foi adotado o modelo de infecção de waxworm g. mellonella a patogenicidade de modelo de uma vasta gama de patógenos bacterianos e fúngicos^12,13,14. Vantagens deste modelo incluem sua taxa de transferência de custo relativamente baixo, maior facilidade de uso e reduziram as preocupações éticas sobre animal beneficência em relação aos modelos de murino. Para os pesquisadores, isso se traduz em maior capacidade de testar várias variáveis, intervalos de confiança mais fortes, mais rápida experimentação e desvio dos protocolos de animais. G. mellonella tem servido como uma plataforma para avaliar rapidamente a virulência de c. albicans após perturbação de genes necessários para regulamento de gene, filamentação e formação de biofilme em isolados clínicos^{11,15 ,16}. Estudos recentes têm incorporado a investigação da eficácia antifúngica usando mellonella g. para avaliar a farmacocinética da droga atividade e resistência sob configurações na vivo , que são outro modo desafiador e demorado ^17,18. Ainda, estudos de virulência de c. albicans em g. mellonella tem sido complicados por alegadamente altos níveis de variação dentro de experiências e protocolos inconsistentes entre grupos de pesquisa que produzem diferentes fenótipos de virulência entre ratos e waxworms^{11,13,19,20,21}. Aqui, nós esboçamos um mellonella g. protocolo para padronizar a reprodutibilidade de aumento de infecções, de c. albicans em experimentos de virulência e demonstrar coerência com o descrito anteriormente estudos de virulência em murino modelos.

Estudos anteriores demonstraram que a c. albicans acasalamento como tipo (MTL) locus no cromossomo 5 regula a identidade da célula e competência semelhante ao Saccharomyces cerevisiae e outros de fungos ascomicetes²²de acasalamento. A maioria dos isolados de c. albicans é heterozigota para o locus MTL , codificação um de cada dos MTLum e MTLα alelos (MTLum/α) e é consequentemente estéril^{15, 23 , 24}. a perda de um dos alelos MTL através da perda de heterozigosidade (LOH) ou mutação leva à homozigotos MTLuma MTLα estirpes ou podem sofrer uma mudança fenotípica do estado estéril ‘branco’ para a acasalamento de Estado competente ‘opaco’²⁵. Trabalhos anteriores evidenciou que a perda de heterozigosidade MTL também reduz virulência em modelos murino de infecção sistêmica através de tensão diferentes origens²⁶. Aqui, detalhamos o modelo g. mellonella para candidíase disseminada, usando um conjunto experimental geneticamente semelhante para retratar o contributo da heterozigosidade MTL de virulência em mellonella g.. Mostramos que a configuração de MTL influenciado patogenicidade de c. albicans , onde cepas MTLα foram menos virulentas em relação tantoum/α MTLe MTLuma células, semelhantes às conclusões dentro de modelo murino de infecção²⁶.

Protocol

Todos os métodos descritos dependem do uso de hospedeiros invertebrados e não requerem aprovação institucional Cuidado Animal e usar Comité (IACUC). 1. larvas de Waxworm galleria mellonella Ordem de larvas de atacadistas e fornecedores que não introduza hormonas, antibióticos ou outros tratamentos para as larvas e que são capazes de enviar e entregar espécimes vivos. Certifique-se de comprar todas as larvas do mesmo fornecedor durante o curso da experimenta?…

Representative Results

Aqui, vamos demonstrar um método reprodutível para o uso de waxworms g. mellonella para investigar um modelo de candidíase disseminada de infecção usando c. albicans. O armazenamento adequado, manutenção e seleção de larvas para infecção são um componente crítico do garantindo a reprodutibilidade em mellonella g. mortalidade (Figura 1A). As larvas saudáveis que estão ativas, têm uma luz cor de amarel…

Discussion

O modelo de waxworm g. mellonella permanece como uma ferramenta eficaz para a análise rápida e reprodutível de virulência de c. albicans . Este protocolo detalhado baseia-se no momento da entrega consistente de uma dose infecciosa definida para o mesmo site através de um lote de larvas. Dose infecciosa tem um profundo impacto sobre a mortalidade mellonella g. Considerando que a utilização de larvas entre sua chegada inicial e dez dias após a recepção produziu resultados semelhantes. P…

Materials

Galleria mellonella	Snackworms.com		Buy twice as many worms as expected to use
10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe	Hamilton	80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack	Fisher	FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack	VWR	87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL	VWR	97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL	Millipore Sigma	EM-EX0276-1S
autoclaved ddH2O