Summary
Vi præsenterer her, en meget tilgængelig protokol for at vurdere den celle bevægelse i menneskelige trofoblast celler ved hjælp af tre in vitro-assays: scratch analysen, transwell invasion analyse og celle spredning assay.
Abstract
Celle bevægelse er en vigtig egenskab for trophoblasts under placenta udvikling og tidligt i graviditeten. Betydningen af ordentlig trofoblast migration og invasion fremgår af graviditet lidelser såsom præeklampsi og intrauterin vækst begrænsning, der er forbundet med utilstrækkelig trofoblast invasion af maternel Vaskulaturen. Desværre er vores forståelse af mekanismerne af hvor moderkagen udvikler fra migrere trophoblasts er begrænset. In vitro-analyse af celle migration via scratch analysen er et nyttigt værktøj til at identificere faktorer, der regulerer trofoblast vandrende kapacitet. Men denne analyse alene ikke definerer de cellulære ændringer, der kan resultere i ændrede celle migration. Denne protokol beskriver tre forskellige in vitro-assays, der bruges kollektivt til at evaluere trofoblast celle bevægelse: scratch analysen, invasion analysen og spredning assay. De protokoller er beskrevet her kan også ændres til brug i andre cellelinjer til at kvantificere celle bevægelse som svar på stimuli. Disse metoder tillade efterforskere at identificere individuelle faktorer, der bidrager til den celle bevægelse og giver en grundig gennemgang af potentielle mekanismer bag tilsyneladende ændringer i celle migration.
Introduction
Placenta udvikling er et afgørende skridt i etableringen af graviditet, påvirker både moderens og fostrets sundhed. Men den mekanistiske grundlag, som denne proces sker er ikke fuldt forstået. Celle migration er en vigtig biologisk proces, der bidrager til oprettelsen og funktioner i moderkagen under graviditet. Efter blastocyst implantation, trophectoderm differentierer til villøs trophoblasts, der dækker overfladen af chorion villi, og er involveret i gas og næringsstof exchange og extravillous trophoblasts (EVTs), som vandrer ud fra villi og invadere den maternelle decidua og Vaskulaturen1. Migration af EVTs er afgørende for remodeling maternel spiral arterier og oprettelse af uteroplacental omsætning til støtte for fostrets vækst2. Utilstrækkelig trofoblast invasion under graviditet medfører unormal placenta udvikling og kan bidrage til graviditetskomplikationer såsom preeclampsia, svangerskabsuge hypertension, intra uterin vækst restriktioner og præterm fødsel3, 4. Derfor er forstå de faktorer, der påvirker trofoblast motilitet afgørende for at bestemme de veje, der er nødvendige for normal placentation.
Trofoblast migration er kontrolleret af et komplekst netværk af signalering molekyler, herunder vækstfaktorer, cytokiner, hormoner og angiogene faktorer5. På grund af begrænsninger af at studere moderkagen in vivo, in vitro-assays udnytte udødeliggjort menneskelige trofoblast celle linjer har været afgørende for at identificere faktorer, der bidrager til trofoblast motilitet. Bunden og invasion assays er blevet brugt flittigt til kvantitativt at vurdere rollen af individuelle molekyler på trofoblast celle migration6,7,8. Men nyttige sideløbende at undersøge, hvordan ændringer i migration kan være forårsaget af ændringer i celle invasionsevne, disse to assays skal redegøre for yderligere mekanismer, der kan bidrage til ændrede priser i celle migration. For eksempel, kan reduktioner satsen for celledelingen resultere i færre celler tilgængelige til at migrere.
Her beskriver vi kvantitative in vitro-metoder til vurdering af trofoblast migration ved hjælp af scratch, celleproliferation og celle invasion assays. I scratch analysen et ensartet sår er lavet i en celle éncellelag og migration af celler til at fylde hullet er målt ved automatiseret, time-lapse billeder af sår størrelse og tæthed af celler i såret. Celle spredning analyse er baseret på beregning af forholdet mellem celler på hvert tidspunkt, i forhold til en kendt udgangspunkt mængde af celler. I celle invasion assay, cellerne udsås på toppen af en ekstracellulære matrix-belagt celle kultur Indsæt kammer (f.eks. Transwell), og antallet af celler, der invaderer gennem den ekstracellulære matrix i svar på kemo-attractant tælles.
Scratch-analysen er en enkel og effektiv værktøj, der kan bruges til at bestemme, hvordan forskellige miljøforhold påvirker celle migration. Spredning og invasion assays kan efterfølgende bruges til at bestemme celleproliferation og invasiv overordnede ændringer i celle migration bidrag. Kollektivt, giver disse assays robust målinger af biologiske processer, der kan bidrage til celle motilitet. To udødeliggjort første trimester trofoblast cellelinjer blev brugt i den beskrevne assays, Swan.71 (Sw.71) og HTR-8/SVneo9,10. Disse assays kan dog også være optimeret til brug i andre celletyper til at identificere centrale modulatorer af celle migration og invasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle forberedelse
- Vedligeholde celler i T-75 kolber i standard vækst medier ved 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfugtighed.
Bemærk: De celler, der bruges i disse eksperimenter var den udødeliggjort første trimester trofoblast celle linjer Swan.71 (Sw.71) og HTR-8/SVneo9,10. Sw.71 cellerne blev opretholdt i DMEM/F-12 suppleret med 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum (FBS), 1.0 mM natrium pyruvat, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM ikke-essentielle aminosyrer, 100 enheder/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. HTR-8/SVneo celler blev opretholdt i RPMI-1640 suppleret med 5% varme-inaktiverede FBS. - Tillad celler replikere indtil de når 90-100% sammenløb. Ved hjælp af en steril vævskultur flow hood Aspirér medier fra kolben og vaske cellerne med 10 mL sterilt 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Opsug PBS og tilsættes 5 mL af 1 x (0,05%) Trypsin-EDTA kolben, og sørg for, at cellerne er omfattet af trypsin. Sted kolbe i laboratoriet rugemaskine vedligeholdes ved 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfugtighed indtil alle celler er skilt fra bunden af kolben (ca 5-10 min).
- Der tilsættes 10 mL pre varmede vækst medier kolben til at deaktivere trypsin-EDTA.
2. Skrab Assay
- Følgende trin 1.4, frø det passende antal celler i et 24-godt plade at opnå 100% sammenløbet i 48 timer.
Bemærk: Det er muligt at udføre de scratch assay med en bred vifte af forskellige plade layout. Det maksimale antal brønde tilladt af værktøjet sår maker er en 96-brønds format. - Den næste dag (dag før bunden assay), ændre medier til phenol-rød frie medier suppleres efter behov, herunder varme-inaktiverede, trækul dextran-strippet FBS.
Bemærk: Andre undersøgelser har anbefalet brugen af medier med lav koncentration FBS (f.eks. 1%) at minimere celleproliferation, som kan bruges som et alternativ i denne protokol11. - På dagen for den ridse assay, forbehandle celler i 30 min. ved at tilføje ønskede behandling til medierne i hver brønd. De skitserede eksperimenter udnyttede køretøj (1 x PBS) og 100 nM dexamethason fortyndet i 1 x PBS.
-
For at skabe ensartede sår, placere sterile 10 µL pipette tips på benene af sår maker værktøj. Sænke tips i den første række af brønde og flytte pladen langs sporet af sår maker indtil pipette tips nå anden siden af brønden.
- Flytte pladen tilbage til udgangspositionen, at tillade pipette tips til stadighed rører bunden af pladen til sikring af en konstant sår på tværs af diameter af brønden. Fjerne og erstatte de sterile 10 µL pipette tips og sænke tips til den næste række af brønde.
- Gentag trin 2.4 indtil alle brønde er ridset.
Bemærk: Hvis et sår maker værktøj ikke er tilgængelig, kan sår være lavet af manuelt skrabning byens brønde med en 10 µL pipette tip. - Omhyggeligt Aspirér medier og forsigtigt vaske cellerne to gange med 1 x PBS. Efter en sidste vask, tilføje suppleres med phenol-rød gratis, strippet eller lav-FBS medier med ønskede behandling eller køretøj (som anvist i trin 2.3).
Bemærk: HTR-8/SVneo blodlegemerne vaskes med suppleres med phenol-røde medier, som vask med 1 x PBS vil forårsage celler til at løsne. - Placer den 24-godt plade der indeholder ridset brønde i den automatiserede, time-lapse imager (Se Tabel af materialer) til huse i et laboratorium inkubator vedligeholdes ved 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfugtighed. Billede brønde med jævne mellemrum efter behov at tillade celler til komplet sårheling (fx hver 2 h til 72 h).
- Beregne sår tæthed og bredde af den software, der er forbundet med den automatiserede, time-lapse imager (Se Tabel af materialer). For at beregne den procentvise ændring i såret størrelse i forhold til størrelsen af den begyndende sår, indstille sår bredden på tidspunkt 0 lig med 100%. Opdele sår størrelse i hver efterfølgende tidspunkt af sår størrelse på tidspunkt 0 og ganger med 100 for at opnå procentdelen (figur 1).
3. invasion Assay
- Følgende trin 1.4, frø det passende antal celler i 6-godt plader tillade celler at nå 90% sammenløbet i 48 h. Bevar celler i et laboratorium inkubator sat til 37 ° C, 5% CO2og 95% fugtighed.
- Den næste dag, ændre medier til phenol-rød frie medier suppleres efter behov, herunder varme-inaktiverede, trækul dextran-strippet FBS.
Bemærk: Celler kan blive forbehandlet på dette tidspunkt afhængig af eksperimentelle design. - På dette tidspunkt, sted hætteglas med 10 mg/mL ekstracellulære matrix (Se Tabel af materialer) på is, og lad den tø op i køleskabet natten over.
- Den næste dag, pre-afkøle invasion assay leverancer ved at placere 24-godt plader, cellekultur indsætter, microcentrifuge rør, og pipette tips i køleskab (4 ° C) i mindst 2 timer før arbejde med det ekstracellulære matrix.
- Ved hjælp af kølet forsyninger i vævskultur hood, fortyndet 10 mg/mL ekstracellulære matrix 1:1 med phenol-rød-gratis, serum-gratis medier til en endelig koncentration på 5 mg/mL.
Bemærk: Altid holde materiel og fortyndet ekstracellulære matrix på is. Forholdet mellem ekstracellulære matrix til medier kan justeres baseret på egenskaberne i den cellelinie, anvendes i analysen. - Ved hjælp af kølet forsyninger i vævskultur hood, Tilsæt 100 μL af fortyndede ekstracellulære matrix til indsætter (Se Tabel af materialer), der er placeret i den 24-godt plade. Sørg for, at matrix er plan uden nogen bobler. Placer den 24-godt plade der indeholder matrix-belagte skær i varmeskab ved 37 ° C at tillade matrix til at hærde.
- For at prep celler til invasion assay, vaske cellerne med 1 mL PBS, 1 x, Aspirér PBS og tilsæt 500 µL 1 x trypsin-EDTA til hver brønd. 6-godt pladen anbringes i laboratoriet inkubator vedligeholdes ved 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfugtighed indtil alle celler er skilt fra bunden af pladen.
- Når celler er skilt, tilføje 500 µL af phenol-rød-gratis, serum-gratis medier til hver brønd i de trypsinized celler.
- Overføre 1.000 µL af fritliggende celler til microcentrifuge tube og spin-ned i 5 min på 400 x g ved 4 ° C.
- Opsug medier og resuspend celler i phenol-rød-gratis, serum-gratis medier (mængde vil afhænge af koncentrationen af celler). Tælle celler ved hjælp af en automatiseret celle counter (Se Tabel af materialer) og justere lydstyrken af cellesuspension til en endelig koncentration på 5 x 105 celler pr. mL.
Bemærk: En hemocytometer og mikroskop kan også bruges til at tælle celler. - Tilføje 600 μl af komplet vækst medier til wells af 24-godt pladen, der skal bruges til invasion assay.
Bemærk: Ekstra chemoattractants eller behandlinger kan føjes til den komplette vækstmediet i godt (nedre kammer). De skitserede eksperimenter tilføjet køretøj (1 x PBS) eller 100 nM dexamethason fortyndet i 1 x PBS til det nederste kammer. - Sted den præ-coatede indsætte i hver brønd, der indeholder komplet vækstmedium, der skal bruges til invasion assay. Derefter tilsættes 200 μl af celler på toppen af hver enkelt præ-coatede celle Indsæt (øverste kammer) til et samlet beløb på 1 x 105 celler.
Bemærk: Som en negativ kontrol for denne analyse, kan et lige saa stort volumen af phenol-rød-gratis, serum-gratis medier (uden celler) føjes til den øverste kammer. - Placer 24-godt plade i laboratoriet rugemaskine vedligeholdes ved 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfugtighed i 24 timer.
Bemærk: Inkubationstid 24 h var optimeret til udødeliggjort første trimester trofoblast celler og yderligere tests kan være nødvendigt at bestemme den påkrævede inkubationstiden hos andre cellelinjer. - Efter natten inkubation, suge de resterende medier fra den øvre og nedre kammer uden at forstyrre den ekstracellulære matrix. Derefter forsigtigt fjerne den ekstracellulære matrix og ikke invaderet celler fra den øverste del af indsatsen med en vatpind, svaberprøven så mange gange som nødvendigt at fjerne ekstracellulære matrix.
- Vask hver sæt 3 x med 1 x PBS, tilføje PBS til både øvre og nedre kamre af brønden. Opsug PBS efter hver vask.
- Fix celler knyttet til skærene ved at placere skær i 100% iskolde methanol i 30 min. ved 4 ° C. Vask indsætter 3 x med 1 x PBS og fjern PBS efter sidste vask. Pletten cellerne knyttet til skær for 10 min med 0,2% krystalviolet i 20% ethanol.
- Skyl 3 x med deioniseret vand og Opsug deioniseret vand efter den sidste vask.
- Lufttørre indstik til 1 time ved stuetemperatur. Brug af pincet og et barberblad, skær forsigtigt bunden membran af indsatsen og montere på et glas dias med den nederste side opad. Tillad montering medier til tørt ved stuetemperatur.
- Få mindst 4 unikke billeder af invaderede celler pr. prøve ved hjælp af et lysmikroskop med en 20 x mål. Tæller antallet af celler i hvert billede og normalisere antallet af celler til kontrolprøver og afbilde data (figur 2).
4. spredning analyse
- Følgende trin 1.4, tælle trypsinized celler fra kolben ved hjælp af en automatiseret celle counter og frø i 6-godt plader med en tæthed på 2 x 105 celler pr. brønd i standard vækst medier.
- Placere celler i et laboratorium inkubator vedligeholdes ved 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfugtighed i 4 timer eller indtil cellerne har overholdt.
- Change media til phenol-rød frie medier suppleres efter behov, herunder varme-inaktiverede, trækul dextran-strippet FBS og tilføje ønskede behandling. De skitserede eksperimenter tilføjet køretøj (1 x PBS) eller 100 nM dexamethason fortyndet i 1 x PBS. Placer 6-godt pladerne i et laboratorium inkubator vedligeholdes ved 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfugtighed.
- Fjerne medier og erstatte med nye medier og behandling hver 48 timer.
- Efter 24, 48 eller 72 h behandling, vaske cellerne med 1 mL af 1 x PBS og tilsæt 500 µL af trypsin-EDTA til hver brønd. Placere 6-godt plade i inkubator, indtil cellerne har løsrevet fra pladen.
- Når celler er skilt fra pladen, tilsættes 500 µL af den suppleres med phenol-rød frie medier at deaktivere trypsin.
- Tilsæt 5 µL trypsinized celler til 5 µL af Trypan blå i en separat tube og bland af pipettering.
- Tælle celler fra hver brønd i dubletter ved hjælp af en automatiseret celle counter.
- Gennemsnitlig antal celler pr. brønd ved hvert tidspunkt og plottet som funktion af tiden (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udødeliggjort menneskers første trimester trofoblast cellelinjer Sw.71 og HTR-8/SVneo blev brugt i disse eksperimenter til at bestemme rollen af glukokortikoider i trofoblast celle migration12. Glukokortikoider blev anvendt i disse eksperimenter, som de har for nylig vist at ændre trofoblast funktioner, selv om alternative behandlinger kunne være brugt12. Begge cellelinjer blev behandlet med køretøjet (1 x PBS) eller 100 nM af syntetisk glukokortikoid dexamethason (Dex) for alle eksperimenter. Såret tæthed og størrelse blev målt hver 2 h i 72 timer ved hjælp af en automatiseret, time-lapse billedbehandlingssystem. Figur 1 viser et eksempel på billeder og resultater fra scratch analysen på forskellige timepoints. Billedeksempler fra 0, 8 og 18 h timepoints for begge behandlinger har været givet (figur 1A). Såret tæthed og sår størrelse gengivelsesegenskaberne over tid for prøver behandlet med køretøjet kontrol (Veh) eller 100 nM Dex (figur 1B). DEX behandling nedsat sår lukning som fastsat af både sår tæthed og sår størrelse, der angiver, at glukokortikoider hæmmer celle migration i første trimester trofoblast celler.
Figur 2 viser et eksempel på billeder taget af celle kultur Indsæt efter invasionen assay. Celler blev behandlet i 24 timer med Veh eller 100 nM Dex. Invaderede celler blev talt fra fire uafhængige gentagelser pr. behandling ved hjælp af fire unikke felter synspunkt pr. replikat. Glukokortikoid behandling reduceret celle invasionsevne, som det fremgår af en 15% reduktion i antallet af invaderede celler.
Figur 3 viser et eksempel på celle spredning assay. Celler blev talt 24, 48 og 72 timer efter behandling med Veh eller 100 nM Dex. Glukokortikoid behandling reduceret celleproliferation, som angivet af færre celler på hvert tidspunkt. Samlet, disse analyser viser, at glukokortikoid eksponering nedsætter celle motilitet ved at hæmme celledelingen og invasion.
Figur 1: celle Scratch Assay. (A) repræsentative billeder af sår for Veh - og Dex-behandlede Sw.71 celler på 0, 8 og 18 h er vist. Røde linjer angiver sår størrelse. (B) sår tæthed og sår størrelse blev målt i Sw.71 og HTR-8/SVneo celler behandles med køretøjet (Veh) eller 100 nM Dex. Billederne blev taget hver 2 h i 72 timer ved hjælp af en automatiseret, time-lapse mikroskop. Data repræsenterer gennemsnittet af fire uafhængige replikater ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: celle Invasion Assay. Invasion assays blev udført med Sw.71 og HTR-8/SVneo celler behandles i 24 timer med køretøjet (Veh) eller 100 nM Dex. (A) repræsentative billeder fra invasionen assay for Veh - og Dex-behandlede celler efter 24 timers inkubation. Indsatte billede er negativ kontrol med ingen celler føjes til den øverste kammer. Billeder taget på 200 x forstørrelse. Skala barer er 120 µm. (B) invaderede celler var talt op og bar grafer repræsenterer den normaliserede middelværdi af fire uafhængige replikater ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: celle spredning Assay. SW.71 og HTR-8/SVneo celler behandles med køretøjet (Veh) eller 100 nM Dex blev talt enhver 24 h ved hjælp af en automatiseret celle counter. Celletal gengivelsesegenskaberne som den gennemsnit ± SEM mindst 11 uafhængige replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne procedure bygger på anvendelse af migration og invasion assays til også at omfatte satsen for celledelingen som en potentiel bidragyder til målte forskelle i trofoblast celle bevægelse. Bruges sammen, er disse in vitro-assays enkle og effektive metoder, der kan bruges til at identificere den cellulære veje, der regulerer trofoblast migration. Som beskrevet ovenfor, kan trofoblast celler behandles med hormoner, cytokiner, vækstfaktorer, eller andre molekyler til at bestemme deres indflydelse på trofoblast bevægelse. Alternativt kan være udtømt target proteiner fra celler til at belyse deres funktionelle rolle i trofoblast motilitet. Identificere centrale modulatorer af trofoblast migration kan give en bedre forståelse af de grundlæggende mekanismer underliggende komplikationer ved graviditet relateret til placenta defekter, herunder preeclampsia, intrauterin vækst begrænsning og præterm fødsel.
Der er flere kritiske trin i denne protokol, der er nødvendige for at opnå nøjagtige resultater. Fordi phenol-rød har østrogene aktivitet ved koncentrationer anvendes i celle kultur medier13, er det vigtigt, at phenol-rød gratis medier bruges til eksperimentelle slutpunkter til at forhindre uønsket aktivering af østrogen receptor i celler. Under transwell invasion assay er det vigtigt at sikre, at den ekstracellulære matrix er homogen, niveau, og at kolde leverancer bruges til at forhindre Præmatur polymerisering af matrixen. Når der udføres celle spredning og invasion assays, er det vigtigt at tælle prøver straks for at undgå re-tilslutning af celler til vævskultur plader. Det bør også tages under overvejelse at celledød skyldes eksperimentel behandling kan påvirke resultaterne af alle tre assays. Derfor markører for celledød (fx laktat dehydrogenase frigivelse, phosphatidylserin udlægning eller DNA nedbrydning) i respons på behandlingen bør evalueres i den eksperimentelle cellelinie forud for evaluering af migration, invasion, og spredning14. Nogle begrænsninger findes for disse assays, for eksempel, processen med at skabe et sår i en celle éncellelag inducerer en celle skade svar end kan forvirre celle migration processen. Desuden kan manuel afskrabning indføre interexperiment variation, selvom udnytter en sår-maker værktøj, der skaber ensartede sår bredder kan delvis afhjælpe denne begrænsning. Ulempen ved invasion assay er at det er et slutpunkt assay, og kinetik bevægelighed ikke nemt nås. På trods af disse begrænsninger, assays beskrevet her giver reproducerbare, kvantitative data på relativt lave omkostninger.
Assays beskrevet her kan også ændres for at måle celle migration i andre celletyper, selv om disse assays ikke ville være egnet til ikke-tilhænger celletyper. I scratch analysen justeres imaging intervaller for time-lapse mikroskopi tilstrækkeligt fange forskelle i antallet af celle migration. Automatiske systemer til levende celle imaging kan fange sår størrelse billeder som ofte som hver 15 min. billeder taget mindst hvert 30 min kan være syet sammen til at oprette en film af sårheling. I invasion assay, koncentrationen af ekstracellulære matrix, det samlede antal celler seedede og varigheden af inkubationen forud for fastsættelse og tælle celler kan justeres til kontoen for den særlige sats af invasionen i forskellige celletyper. I celle spredning assay, kan antallet af celler seedede på pladerne og tidspunkter for celle optælling justeres til konto for forskellige satser for cellevækst. Samlet, disse assays er fleksible og meget tilgængelige værktøjer, der kan bruges i en lang række celletyper til at identificere de underliggende celle migration mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Dr. Gil Mor for at give Sw.71 cellerne. Denne forskning blev støttet af en Albert McKern Scholar Award til S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).
