نظام التوجيهي "الثغور متفاوت" "السكر الحل العلاج الغمر" في شتلات نبات التمويل
Summary
والهدف من هذا البروتوكول إظهار كيفية حمل الثغور متفاوت المسافات في cotyledons شتلات نبات التمويل بمعاملة الغمر بمحلول متوسطة المحتوية على السكر وكيفية مراقبة هياكل داخل الخلايا مثل المعايشة والليزر microtubules في الخلايا الحرس متفاوت المسافات باستخدام [كنفوكل] مجهرية.
Abstract
حركة stomatal يتوسط تبادل الغازات في النبات، هو أمر ضروري لعملية التمثيل الضوئي والرشح. ستوماتال فتح وإغلاق يتم إنجازه بزيادة كبيرة وانخفاض في حجم الخلية الحرس، على التوالي. نظراً لحدوث النقل المكوكية من الأيونات والماء بين خلايا الحرس وخلايا البشرة المجاورة أكبر أثناء حركة ستوماتال، يعتبر توزيع الثغور النباتية متباعدة توزيع أمثل لحركة ستوماتال. نظم تجريبية لزعزعة نمط متباعدة من الثغور مفيدة لدراسة أهمية على نمط تباعد. وقد حددت عدة الجينات الرئيسية المرتبطة بتوزيع ستوماتال متباعدة، والثغور متفاوت المسافات يمكن أن يتسبب تجريبيا بتغيير هذه الجينات. بدلاً من ذلك، يمكن أن يتسبب أيضا الثغور متفاوت المسافات بالعلاجات الخارجية دون التعديل الوراثي. في هذه المقالة، يصف لنا نظام تعريفية بسيطة الثغور متفاوت المسافات في شتلات نبات التمويل بمعاملة الغمر مع حل متوسطة التي تحتوي على السكروز. لدينا طريقة سهلة وتسري مباشرة على خطوط المحورة وراثيا أو المسخ. وترد المعايشة أكبر كعلامة مميزة خلية بيولوجية الناجمة عن السكروز خلايا الحرس متفاوت المسافات. وبالإضافة إلى ذلك، يظهر صورة مجهرية [كنفوكل] ممثل microtubules القشرية كمثال للمراقبة داخل الخلايا من خلايا الحرس متفاوت المسافات. يتم الاحتفاظ باتجاه شعاعي microtubules القشرية في مجمع الحرس الخلايا كما هو الحال في خلايا الحرس متباعدة في ظروف السيطرة.
Introduction
ستوما النباتات جهازا أساسيا لتبادل الغازات لعملية التمثيل الضوئي والرشح، وهو إنجاز حركة ستوماتال بتغييرات كبيرة في خلايا الحرس عن طريق امتصاص أيون يحركها والإفراج عن المياه. تحت مجهر، يمكننا أن نلاحظ نمط توزيع متباعدة من الثغور على أسطح الأوراق والسيقان. ويعتبر هذا التوزيع متباعدة من الثغور للمساعدة في حركة ستوماتال، والتي يتم تنظيمها بواسطة تبادل الأيونات والماء بين خلايا الحرس والمجاورة لخلايا البشرة1،2. نظم تعريفية تجريبية الثغور متفاوت المسافات مفيدة للتحقيق أهمية توزيع الثغور متباعدة.
وأفيد أن التكتل المكاني من الثغور يمكن أن يتسبب بالتعديل الوراثي للجينات الرئيسية لحراسة الخلية التمايز3،4 أو العلاج مركب الكيميائي5. كذلك أبلغنا أن تستكمل العلاج الغمر بمحلول متوسطة مع السكريات بما في ذلك السكروز، الجلوكوز، وتسبب سكر تجميع ستوماتال في كوتيليدونس من شتلات نبات التمويل 6. ولوحظ كالوسي انخفاض في جدران الخلايا الجديدة فصل ميريستيمويدس وخلايا البشرة في البشرة المعالجة السكروز كوتيليدون، مما يوحي بأن السكروز الحل الغمر العلاج يؤثر سلبا على جدار الخلية، مما يمنع التسرب و العمل خارج الرحم من منتجات الجينات الرئيسية لتمايز خلية الحرس (مثل عوامل النسخ) نحو المتاخمة البشرة الخلايا6. واقترح إليه مماثلة من الدراسات على gsl8/تشور طفرات7،8. لدينا نظام تجريبي لاستنساخه بتحريض من الثغور متفاوت المسافات باستخدام الحلول المتوسطة التي تحتوي على السكروز سهلة ورخيصة جداً. يمكن استخدامه أيضا التحقيق فيها الهياكل داخل الخلايا مثل العضيات وسيتوسكيليتون في خلايا الحرس متفاوت المسافات عند تطبيقه على خطوط المعدلة وراثيا معربا عن علامات نيون أن تسمية هياكل داخل الخلايا9، 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد قدمنا البروتوكولات لتحريض الثغور متفاوت المسافات في التمويل ألف شتلة بمعاملة الغمر مع حل متوسطة التي تحتوي على السكروز. كما هو موضح هنا، هذا الأسلوب بسيط جداً ويتطلب أي مهارة متخصصة لكن يمكن حمل كفاءة الثغور متفاوت المسافات. تتجمع أكثر من 45 في المائة خلايا الحرس مع 3% السكروز المح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للبروفيسور سيشيرو هاسيزاوا على دعمه الكريم لعملنا. أيد هذا العمل المنح المقدمة من “الجمعية اليابانية” لأرقام كاكينهجرانت النهوض بالعلوم (JSPS) 17 ك 19380 ومنح 18 ح 05492، من مؤسسة سوميتومو للحصول على منح “مشاريع بحوث العلوم الأساسية” رقم 160146، و “مؤسسة كانون” T.H. ووضعت هذا النظام التجريبي تحت دعم المالي من عدد كاكينهجرانت JSPS 26891006 إلى أ. ك. ونحن نشكر روبي لويس، ماجستير، من مجموعة ادانز (www.edanzediting.com/ac) لتحرير مسودة للمخطوطة.
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
