En induksjon System for samlet Stomata av sukker løsning nedsenking behandling i Arabidopsis thaliana planter
Summary
Målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan å indusere gruppert stomata i cotyledons av Arabidopsis thaliana frøplanter av nedsenking behandling med en sukker inneholder middels løsning og observere intracellulær strukturer som chloroplasts og piskehale som henger i de grupperte cellene med AC confocal laser mikroskopi.
Abstract
Øverst bevegelse formidler anlegget gassutveksling, som er avgjørende for fotosyntesen og transpirasjon. Øverst åpning og lukking gjøres ved en betydelig økning og nedgang i vakt celle volum, henholdsvis. Fordi skyttel ioner og vann oppstår mellom celler og større nærliggende epidermal celler under øverst bevegelse, anses linjeavstand fordelingen av anlegget stomata en optimal fordeling for øverst bevegelse. Eksperimentell systemer for perturbing linjeavstand mønster av stomata er nyttige å undersøke avstand mønsterets betydning. Flere viktige gener tilknyttet den linjeavstand øverst fordelingen er identifisert, og klynger stomata kan eksperimentelt indusert ved å endre disse genene. Alternativt kan gruppert stomata også indusert ved eksogene behandlinger uten genmodifisering. I denne artikkelen beskriver vi en enkel induksjon system for grupperte stomata i Arabidopsis thaliana planter av nedsenking behandling med en sukrose inneholder middels løsning. Vår metode er enkelt og direkte gjelder transgene eller mutant linjer. Større chloroplasts presenteres som en celle biologiske kjennetegner sukrose-indusert gruppert celler. I tillegg vises et representativt AC confocal mikroskopiske bilde kortikale piskehale som henger som et eksempel på intracellulær observasjon av gruppert celler. Radial retningen kortikale piskehale som henger opprettholdes i grupperte celler som spredte celler i kontroll forhold.
Introduction
Anlegget stomi er et viktig organ for gassutveksling for fotosyntesen og transpirasjon øverst bevegelse oppnås ved betydelige endringer i celler gjennom ion-drevet opptak og flushing. Under et mikroskop, kan vi observere en avstand fordelingsmønster av stomata på overflater av blader og stengler. Linjeavstand distribusjonen av stomata anses å øverst bevegelse, som er regulert av ion og vann utveksling mellom celler og nabolandet epidermal celler1,2. Eksperimentell induksjon systemer for grupperte stomata er nyttige for å undersøke betydningen av linjeavstand distribusjon av stomata.
Det har blitt rapportert at romlig klynging av stomata kan indusert ved genmodifisering av viktige gener for vakt cellen differensiering3,4 eller behandling med kjemisk sammensatte5. Vi rapporterte også at nedsenking behandling med en middels løsning supplert med sukker inkludert sukrose, glukose, og fruktose forårsaket øverst klynging i cotyledons Arabidopsis thaliana frøplanter6. Redusert callose i ny cellen vegger skille meristemoids og epidermal celler ble observert i sukrose-behandlet cotyledon overhuden, antyder at sucrose løsning nedsenking behandling negativt påvirker cellen vegg, som hindrer lekkasje og ektopisk handling av nøkkel genprodukter for vakt celledifferensiering (f.eks transkripsjonsfaktorer) mot tilstøtende epidermal cellene6. En tilsvarende ordning ble foreslått fra studier på gsl8/chor mutanter7,8. Vår eksperimentelle system for reproduserbar induksjon av klyngede stomata bruker sukrose inneholder middels løsning er ganske enkelt og billig. Det kan også brukes til å undersøke intracellulær strukturer som organeller og cytoskeleton i de grupperte cellene når transgene linjer uttrykke fluorescerende markører som etiketten intracellulær strukturer9, 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har presentert protokoller for induksjon av klyngede stomata i A. thaliana seedlings av nedsenking behandling med en sukrose inneholder middels løsning. Som vist her, denne metoden er veldig enkelt og krever ingen spesialisert kompetanse men effektivt kan indusere gruppert stomata. Mer enn 45% av celler klynger med 3% sukrose inneholder middels løsning (mener verdier av mer enn 20 uavhengige observasjoner)6. Videre kan eksperimentell systemet brukes direkte til transgene eller mutant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til Prof Seiichiro Hasezawa slag underhold av vårt arbeid. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) KAKENHgrant nummer 17K 19380 og 18 H 05492, fra Sumitomo stiftelsen for stipend for grunnleggende vitenskap prosjekter gir flere 160146 og Canon stiftelsen å th Eksperimentell systemet ble utviklet under en økonomisk støtte fra nummeret Javaserver KAKENHgrant 26891006 til K. A. Vi takker Robbie Lewis, MSc, fra Edanz gruppe (www.edanzediting.com/ac) for å redigere et utkast av manuskriptet.
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
