Un sistema di induzione per cluster stomi da trattamento di immersione di soluzione di zucchero nei semenzali di Arabidopsis thaliana
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è illustrare come indurre cluster stomi nei cotiledoni di Arabidopsis thaliana piantine dal trattamento ad immersione con una soluzione di media contenenti zucchero e come osservare strutture intracellulari quali cloroplasti e microtubuli nelle cellule di guardia in cluster utilizzando confocale microscopia laser.
Abstract
Stomatica movimento media lo scambio di gas della pianta, che è essenziale per la fotosintesi e traspirazione. Apertura e di chiusura stomatica sono compiute da un significativo aumento e diminuzione nel volume delle cellule di guardia, rispettivamente. Perché il servizio di trasporto di ioni e acqua avviene tra cellule di guardia e cellule epidermiche vicine più grandi durante il movimento stomatica, la distribuzione distanziata di stomi pianta è considerata una distribuzione ottimale per il movimento stomatica. Sistemi sperimentali per perturbare il modello distanziato di stomi sono utili per esaminare il significato del pattern spaziatura. Sono stati identificati diversi geni chiave associate alla distribuzione stomatica distanziata e stomi cluster possono essere sperimentalmente indotta alterando questi geni. In alternativa, gli stomi cluster possono essere anche indotta da trattamenti esogeni senza modificazione genetica. In questo articolo, descriviamo un sistema di induzione semplice per cluster stomi nei semenzali di Arabidopsis thaliana dal trattamento ad immersione con una soluzione Media contenente saccarosio. Il nostro metodo è facile ed è direttamente applicabile alle linee transgeniche o mutante. Più grandi dei cloroplasti sono presentati come un marchio di garanzia biologico delle cellule delle cellule di guardia cluster indotta da saccarosio. Inoltre, un’immagine al microscopio confocale rappresentativa dei microtubuli corticali è indicata come un esempio dell’osservazione intracellulare delle cellule di guardia in cluster. L’orientamento radiale dei microtubuli corticali è mantenuto in cluster cellule di guardia come nelle cellule di guardia distanziate in condizioni di controllo.
Introduction
Lo stoma di pianta è un organo essenziale per lo scambio di gas per la fotosintesi e traspirazione, e movimento stomatica è compiuto dai cambiamenti significativi nelle cellule di guardia attraverso l’assorbimento dello ione-driven e rilascio di acqua. Sotto un microscopio, possiamo osservare un modello di distribuzione distanziati di stomi sulle superfici delle foglie e steli. Questa distribuzione distanziata di stomi è considerata per aiutare il movimento stomatica, che è regolata da scambio di acqua e ioni tra cellule di guardia e vicine cellule epidermiche1,2. Sistemi ad induzione sperimentale per cluster stomi sono utili per indagare l’importanza della distribuzione distanziata di stomi.
È stato segnalato che spatial clustering di stomi può essere indotta da modificazioni genetiche di geni chiave per la differenziazione delle cellule di guardia3,4 o il trattamento con un composto chimico5. Abbiamo anche riferito che il trattamento ad immersione con una soluzione media completati con zuccheri tra cui saccarosio, glucosio, e fruttosio causato stomatica clustering in cotiledoni di Arabidopsis thaliana piantine6. Callosio ridotta in nuove pareti cellulari che separa meristemoids e cellule epidermiche è stata osservata nell’epidermide saccarosio-trattati cotiledone, suggerendo che il saccarosio soluzione immersione trattamento colpisce negativamente la parete cellulare, che impedisce la fuoriuscita e azione ectopica dei prodotti del gene chiave per la differenziazione delle cellule di guardia (ad es. fattori di trascrizione) verso adiacente epidermica cellule6. Un meccanismo simile è stato suggerito da studi sulla gsl8/chor mutanti7,8. Il nostro sistema sperimentale per induzione riproducibile di stomi cluster utilizzando soluzione Media contenente saccarosio è abbastanza facile ed economico. Può anche essere utilizzato per indagare le strutture intracellulari come organelli e il citoscheletro nelle cellule di guardia del cluster quando applicato a linee transgeniche che esprimono marcatori fluorescenti che etichetta strutture intracellulari9, 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato protocolli per l’induzione di stomi cluster in a. thaliana piantine dal trattamento ad immersione con una soluzione Media contenente saccarosio. Come mostrato qui, questo metodo è molto semplice e non richiede nessuna abilità specializzata ma efficiente può indurre gli stomi cluster. Oltre il 45% delle cellule di guardia sono raggruppati con 3% saccarosio-contenente soluzione medio (valori medi di più di 20 osservazioni indipendenti)6. Inoltre, questo sistema sperim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Prof. ssa Seiichiro Hasezawa per il suo gentile sostegno del nostro lavoro. Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHgrant numeri 17K 19380 e 18 H 05492, dalla Fondazione per una sovvenzione per progetti di ricerca di scienza base Sumitomo concede numero 160146 e la Canon Foundation di T.H. Questo sistema sperimentale è stato sviluppato sotto un sostegno finanziario dal numero di pagine JSP KAKENHgrant 26891006 a K. A. Ringraziamo Robbie Lewis, MSc, dal gruppo di Esposito (www.edanzediting.com/ac) per la modifica di una brutta copia del manoscritto.
Materials
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 – 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 – 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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