Medición de la forma y el tamaño de las partículas de lodo activado inmovilizado en Agar con una tubería de Software de código abierto
Summary
El tamaño y forma de las partículas de lodos activados son parámetros importantes que se miden utilizando diferentes métodos. Errores surgen de muestreo no representativo, imágenes subóptimas y parámetros de análisis subjetivo. Para minimizar estos errores y facilitar la medición, presentamos un protocolo especificando cada paso, incluyendo un oleoducto de software de código abierto.
Abstract
Bioreactores experimentales, tales como ésos tratamiento de aguas residuales, contienen partículas cuyo tamaño y forma son parámetros importantes. Por ejemplo, el tamaño y la forma de flóculos de lodo activado pueden indicar las condiciones en la microescala y afectan también directamente cómo el lodo se instala en un clarificador.
Forma y tamaño de las partículas son ambas medidas misleadingly ‘simples’. Muchas cuestiones sutiles, a menudo ignoradas en protocolos informales, pueden surgir cuando el muestreo, la proyección de imagen y análisis de partículas. Métodos de muestreo pueden ser sesgados o no proporcionan suficiente poder estadístico. Las muestras se pueden llevar mal o sufren alteración durante la inmovilización. Las imágenes pueden ser de calidad suficiente; superposición de partículas, profundidad de campo, nivel de ampliación y ruidos varios puede todos producir malos resultados. Mal especificado análisis pueden introducir sesgos, como el producido por segmentación y umbral de imagen manual.
Rendimiento y la asequibilidad son deseables junto con reproducibilidad. Un método asequible, de alto rendimiento permite medición de partícula más frecuente, produciendo muchas imágenes que contiene miles de partículas. Un método que utiliza reactivos de bajo costo, un microscopio de disección común y libremente disponibles análisis software libre permite resultados experimentales repetibles, accesibles, reproducibles y parcialmente automatizado. Además, el producto de dicho método puede ser bien formateado, bien definido y fácil de entender por software de análisis de datos, facilitando datos entre laboratorios y análisis en laboratorio.
Presentamos un protocolo que detalla los pasos necesarios para producir un producto, incluyendo: toma de muestras, la muestra preparación e inmovilización en agar, adquisición de imagen digital, análisis digital de imágenes y ejemplos de generación específicos del experimento figura de la resultados del análisis. También hemos incluido un gasoducto de análisis de datos de código abierto para apoyar este protocolo.
Introduction
El propósito de este método es proporcionar un método bien definido, repetible y parcialmente automatizados para determinar las distribuciones de tamaño y forma de las partículas en biorreactores, especialmente aquellas que contienen los flóculos de lodo activado y gránulos aerobios1 , 2. el fundamento de este método mejorar la accesibilidad, sencillez, rendimiento y repetibilidad de nuestros actuales protocolos internos3,4, facilitar la medición de partículas de otros, facilitar el intercambio y comparación de los datos.
Hay dos categorías generales de análisis de medición de partículas – métodos directo imágenes e inferenciales mediante tales cualidades como la dispersión de la luz5. Aunque métodos inferenciales pueden ser automatizados y tienen gran rendimiento, el equipo es caro. Además, mientras métodos inferenciales pueden determinar con precisión el tamaño equivalente de una partícula6, no proporcionan información de forma detallada7.
Debido a la necesidad de datos de formas, nos hemos basado nuestro método en la proyección de imagen directa. Aunque existen algunos métodos de proyección de imagen de alto rendimiento, ha requerido tradicionalmente caro hardware comercial o soluciones construido8,9. Nuestro método ha sido desarrollado para emplear común y asequible hardware y software que, aunque sufren de una reducción en el rendimiento, produce imágenes de partículas mucho más que el mínimo necesario para muchos análisis10.
No debe especificar los protocolos muestreo importante y los pasos de adquisición de imagen. Otros protocolos pueden especificar pasos manuales que introducen sesgos subjetivos (tales como umbral ad hoc11). Un método bien definido que especifica los pasos de adquisición muestreo, inmovilización e imagen combinados con software de análisis gratuitamente mejorará tanto dentro del laboratorio de imagen análisis y comparaciones entre laboratorios. Un objetivo principal de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo y herramientas que deben conducir a resultados reproducibles de diferentes laboratorios para la misma muestra.
Además de normalizar el proceso de análisis de imagen, los datos producidos por este gasoducto se registran en un archivo bien definidos y bien formateado,12 adecuado para uso popular datos análisis paquetes13,14, experimento de relajación análisis específicos (como la generación de la figura de encargo) y facilitar información entre laboratorios.
Este protocolo se recomienda especialmente para los investigadores que requieren datos de forma de partícula, no tienen acceso a los métodos inferenciales, desea desarrollar su propia tubería de análisis de imagen y desea compartir sus datos fácilmente con otros
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque el sistema de análisis de imagen es bastante robusto y pasos de control de calidad se toman para asegurar imágenes pobres se retiran, la atención adecuada a problemas específicos en la adquisición de la imagen, muestreo y preparación de las placas puede mejorar tanto la precisión de los datos y la proporción de imágenes pasando del control de calidad.
Concentración de muestras
Suponiendo que se ha tomado una muestra representativa, es el paso más important…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una subvención de la nacional Science Foundation CBET 1336544.
Los logotipos de FIJI, R y Python se utilizan con el de acuerdo con las siguientes políticas de marca registrada:
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , según la licencia CC-BY-SA 4.0 en: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Fiji: https://imagej.net/Licensing
Materials
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
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