Måling af form og størrelse af aktiveret slam partikler immobiliseret i Agar med en Open Source Software-rørledningen

Summary

Størrelse og form af partikler i aktiveret slam er vigtige parametre, der er målt ved hjælp af forskellige metoder. Unøjagtigheder opstår fra ikke-repræsentative stikprøver, suboptimal billeder og subjektive analyseparametre. For at minimere disse fejl og lette måling, præsenterer vi en protokol, angive hvert skridt, herunder en open source software rørledning.

Abstract

Eksperimentelle bioreaktorer, såsom de behandling af spildevand, indeholder partikler, hvis størrelse og form er vigtige parametre. For eksempel, kan størrelse og form af aktiveret slam flocs angive betingelser på en individuel, og også direkte påvirke, hvor godt slammet afregner i en afklaring.

Partikelstørrelse og form er både misvisende ‘simpel’ målinger. Mange subtile spørgsmål, ofte adresseløse i uformelle protokoller, kan opstå når prøvetagning, imaging og analysere partikler. Prøveudtagningsmetoder kan være forudindtaget eller levere ikke strøm nok statistiske. Prøverne sig selv kan være dårligt bevaret eller gennemgå ændring under immobilisering. Billeder kan ikke være af tilstrækkelig god kvalitet; overlappende partikler, kan dybdeskarphed, forstørrelsesniveau, og forskellige støj alle producere dårlige resultater. Dårligt specificerede analyse kan indføre bias, som der produceres af manuel billede tærskel og segmentering.

Overkommelige priser og overførselshastighed er ønskeligt sammen med reproducerbarhed. En overkommelig pris, høj overførselshastighed metode kan aktivere hyppigere partikel måling, producerer mange billeder, der indeholder tusindvis af partikler. En metode, der bruger billig reagenser, en fælles dissekere mikroskop og frit tilgængelige open source analyse software giver repeterbare, tilgængelige, reproducerbare og delvist automatiseret eksperimentelle resultater. Yderligere, produktet af en sådan metode kan være godt formateret, velafgrænset og let at forstå data analyse software, lette både inden for lab analyser og datadeling mellem labs.

Vi præsenterer en protokol, der beskriver de nødvendige skridt for at producere sådan et produkt, herunder: prøvetagning, prøve forberedelse og immobilisering i agaren, digitalt billede erhvervelse, digital billedanalyse og eksempler på eksperiment-specifikke tal generation fra den analyseresultater. Vi har også inkluderet en open-source data analyse rørledningen for at understøtte denne protokol.

Introduction

Formålet med denne metode er at give en veldefineret, repeterbare og delvist automatiseret metode til bestemmelse af størrelse og form distributioner af partikler i bioreaktorer, især dem der indeholder aktiveret slam flocs og aerob granulat^{1 , 2}. rationalet bag denne metode var at øge overkommelighed, enkelhed, overførselshastighed, og repeterbarhed af vores eksisterende in-house protokoller^3,4, lette partikel måling for andre, og lette deling og sammenligning af data.

Der er to hovedkategorier af partikel måling analyse – direct imaging og inferential metoder ved hjælp af sådanne kvaliteter som lysspredning⁵. Selvom inferential metoder kan automatiseres og har store overførselshastighed, er udstyret dyrt. Hertil kommer, mens inferential metoder kan præcist bestemme den tilsvarende størrelse af en partikel⁶, giver de ikke detaljeret form information⁷.

På grund af behovet for Figurdata, har vi baseret vores metode på direkte billeddannelse. Mens nogle høj overførselshastighed Billeddannende metoder findes, har de traditionelt kræves enten dyre kommercielle hardware eller specialløsninger bygget^8,9. Vores metode er blevet udviklet for at anvende fælles, overkommelige hardware og software, der selv lider af en reduktion i overførselshastighed, producerer langt mere partikel billeder end det minimum, der er nødvendige for mange analyser¹⁰.

Eksisterende protokoller kan ikke angive vigtige prøveudtagning og image erhvervelse trin. Andre protokoller kan angive manuelle trin, der indfører subjektiv bias (såsom ad hoc-tærskel¹¹). En veldefineret metode, der angiver prøveudtagning, immobilisering og image erhvervelse trin kombineret med frit tilgængelige analyse software vil forbedre både inden for lab billedanalyse og sammenligninger mellem labs. Et vigtigt mål i denne protokol er at give en arbejdsproces og værktøjer, der bør føre til reproducerbare resultater fra forskellige labs for samme prøve.

Bortset fra normalisere billede analyse proces, er data produceret af denne rørledning registreret i en veldefineret, godt formateret fil¹² egnet til brug af populære data analyse pakker^13,14, lempelse eksperiment specifikke analyser (f.eks. brugerdefinerede figur generation) og lette datadeling mellem labs.

Denne protokol er især foreslået for forskere, der kræver partikel Figurdata, har ikke adgang til inferential metoder, ikke ønsker at udvikle deres eget billede analyse pipeline, og ønsker at dele deres data nemt med andre

Protocol

1. indsamle prøver for partikel analyse Bestemme sample volumen for specifikke reaktorer, der vil producere tilstrækkeligt partikler for statistisk analyse10 (> 500) samtidig undgå partikel overlapning. Antage, at en række 0,5 til 2 mL pr. sample af blandet spiritus er tilstrækkelig for aktiverede slam prøver med en blandet spiritus suspenderet tørstof (MLSS) mellem 250 og 5.000 mg/L. Ellers, forberede tre test agar plader ved hjælp af 0,5, 2 og 5 mL af prøven…

Representative Results

Filer genereretDen proces, der er illustreret i figur 1 vil producere to filer pr billede analyseret. Den første fil er et komma separeret værdi (CSV) tekstfil, hvor hver enkelt række svarer til en enkelt partikel og kolonnerne beskrive forskellige partikel målinger som område, cirkularitet og soliditet og defineret i ImageJ manuel17. Eksempel CSV-filer er inkluderet som supplerende oplysninger og i mappen eks…

Discussion

Selv om billedet analysesystem er temmelig robust og QC skridt til at sikre fattige billeder er fjernet, kan behørig opmærksomhed på specifikke emner i prøvetagning, plade forberedelse og image erhvervelse forbedre både nøjagtigheden af oplysningerne og andelen af billeder passerer QC.

Prøveudtagning koncentration
Under forudsætning af en repræsentativ prøve er taget, er det vigtigste skridt at sikre, at tilstrækkelig partikler er til stede for repræsentative<su…

Materials

10% Bleach solution	Chlorox	31009	For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap	Corning	430790	Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask	Corning	4980-50	Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	Or otherwise sufficient for agar handling
Agar	BD	214010	Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software	N/A	N/A	R or Python are suggested
Deionized water	N/A	N/A	Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer	N/A	N/A	Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive	Seagate	STEB5000100	Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI	NIH	version 1.51d	Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	version 2.19.1 or later	Available at: https://git-scm.com/
Image capture software	ToupView	version 3.7.5177	Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage	OMAX	A512	Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue	Fisher	M291-100	Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera	OMAX	A35140U	Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per sample.
PPE	N/A	N/A	Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope	Nikon	SMZ-2T	Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.