Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas
Summary
Este protocolo detalha um monolayer, método soro-livre para gerar eficientemente Hepatocyte-como pilhas das pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em 18 dias. Isto implica seis etapas como hPSCs se diferenciam seqüencialmente em tipos de células intermediárias, como a raia primitiva, endoderma definitivo, foregut posterior e progenitores de broto hepático antes de formar células como hepatócitos.
Abstract
O fígado desintoxica substâncias nocivas, secreta proteínas vitais, e executa as principais atividades metabólicas, sustentando assim a vida. Consequentemente, a insuficiência hepática — que pode ser causada por ingestão crônica de álcool, hepatite, envenenamento agudo ou outros insultos — é uma condição grave que pode culminar em sangramento, icterícia, coma e, eventualmente, morte. Entretanto, as aproximações para tratar a falha de fígado, assim como estudos da função e da doença de fígado, foram stymied na parte pela falta de uma fonte abundante de pilhas humanas do fígado. Para este fim, este protocolo detalha a diferenciação eficiente de pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em Hepatocyte-como pilhas, guiado por um roteiro desenvolvente que descreva como o Fate do fígado está especificado através de seis etapas consecutivas da diferenciação. Manipulando as vias de sinalização do desenvolvimento para promover a diferenciação hepática e para suprimir explicitamente a formação de Fates celulares indesejados, este método gera eficientemente populações de progenitores de gemas hepáticas humanas e células como hepatócitos por dias 6 e 18 de diferenciação do PSC, respectivamente. Isto é conseguido através do controle temporally-preciso de caminhos de sinalização desenvolventes, exercitado por moléculas pequenas e por factores de crescimento em um meio de cultura soro-livre. A diferenciação neste sistema ocorre em monocamadas e produz células hepatócito-like que expressam enzimas de hepatócitos característicos e têm a capacidade de entransplantar um modelo de rato de insuficiência hepática crónica. A capacidade de gerar eficientemente um grande número de células hepáticas humanas in vitro tem ramificações para o tratamento da insuficiência hepática, para a triagem de drogas, e para estudos mecanísticos de doença hepática.
Introduction
A finalidade deste protocolo é diferenciar eficientemente pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em populações enriquecidas de progenitores do botão do fígado e Hepatocyte-como pilhas2. O acesso a um suprimento pronto de progenitores hepáticos humanos e células semelhantes a hepatócitos acelerará os esforços para investigar a função hepática e a doença e poderá permitir novas terapias de transplante celular para insuficiência hepática3,4, a 5. Isso tem provado desafiador no passado desde hPSCs (que incluem células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas) pode diferenciar em todos os tipos de células do corpo humano; Conseqüentemente, tem sido difícil diferenciá-los exclusivamente em uma população pura de um único tipo de célula, como as células hepáticas6.
Para diferenciar precisamente hPSCs em pilhas de fígado, primeiramente é crítico compreender não somente como as pilhas de fígado são especificadas mas igualmente como os Cell-Types do não-fígado se desenvolvem. O conhecimento de como as células não-hepáticas se desenvolvem é importante para suprimir logicamente a formação de linhagens não hepáticas durante a diferenciação, orientando, assim, exclusivamente hPSCs para um destino hepático2. Em segundo lugar, é essencial delinear as múltiplas etapas de desenvolvimento através das quais os hPSCs se diferenciam para um destino hepático. Sabe-se que os hPSCs se diferenciam sequencialmente em múltiplos tipos de células conhecidas como a raia primitiva (APS), endoderma definitivo (DE), foregut posterior (PFG) e progenitores de broto hepático (LB) antes de formar células de hepatócitos (HEP). O trabalho mais adiantado revelou os sinais que especificam o Fate do fígado e os sinais que suprimiram a formação de pilha-tipos alternativos do não-fígado (que incluem os progenitors do estômago, os pancreatic, e os intestinais) em cada escolha2do desenvolvimento da linhagem, 7 anos de , a 8.
Coletivamente, esses insights deram origem a um método de monocamada sem soro para diferenciar hPSCs em direção à raia primitiva, endoderma definitivo, foregut posterior, progenitores de broto hepático e, finalmente, células tipo hepatócitos2. Globalmente, o método envolve a semeadura de hPSCs em uma monocamada em uma densidade adequada, preparando seis coquetéis de meios de diferenciação (contendo fatores de crescimento e pequenas moléculas que regulam várias vias de sinalização de desenvolvimento), e sequencialmente adicionando esses meios para induzir a diferenciação ao longo de 18 dias. Durante o processo, nenhum de de células é necessário. De notar, porque este método inclui explicitamente sinais que suprimem a formação de células não-fígado-tipos, esta abordagem de diferenciação1 mais eficientemente gera progenitores do fígado e hepatócitos-como células em comparação com existentes métodos de diferenciação2,9,10,11,12. Além disso, o protocolo descrito neste texto possibilita a geração mais rápida de hepatócitos que, em última análise, expressam níveis mais elevados de fatores de transcrição hepática e enzimas do que os produzidos por outros protocolos9,10 , 11 anos de , doze anos.
O protocolo aqui descrito tem algumas vantagens sobre os protocolos de diferenciação atuais. Em primeiro lugar, implica diferenciação monocamada de hPSCs, que é tecnicamente mais simples em comparação com métodos de diferenciação tridimensional, como aqueles que dependem de corpos embrióides13. Em segundo, este método explora um avanço recente por meio de que as pilhas definitivas do endoderme (um precursor adiantado às pilhas de fígado) podem eficientemente e ràpida ser geradas dentro de 2 dias da diferenciação2,7de HPSC, assim permitindo a subsequente produção de hepatócitos com maior pureza. Em terceiro lugar, nas comparações lado a lado, as células do tipo hepatócito produzidas por este método2 produzem mais albumina e expressam níveis mais elevados de fatores de transcrição hepática e enzimas em comparação com os hepatócitos produzidos em outros métodos10, 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método permite a geração de populações enriquecidas de progenitores do botão do fígado, e subseqüentemente Hepatocyte-como pilhas, de hPSCs. A capacidade de gerar populações enriquecidas de células hepáticas humanas é importante para a utilização prática de tais células. Métodos prévios para gerar hepatócitos de hPSCs produziram populações de células impuras contendo células hepáticas e não hepáticas que, após transplante em roedores, produziram osso e cartilagem além do tecido hepático…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Bing Lim para discussões e do Stanford Institute for Stem Cell Biology & medicina regenerativa para suporte de infra-estrutura. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de medicina regenerativa da Califórnia (DISC2-10679) e pelo Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (para L.T.A. e K.M.L.) e o centro de Stanford Beckman para medicina molecular e genética, bem como o Anonymous, Famílias de Baxter e de DiGenova (a K.M.L.).
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
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