Effektiv differentiering av humana pluripotenta stamceller till leverceller
Summary
Detta protokoll specificerar en monolayer, serum fri metod för att effektivt generera hepatocyte-liknande celler från humana pluripotenta stamceller (hPSCs) i 18 dagar. Detta innebär sex steg som hpscs sekventiellt differentieras till mellanliggande cell-typer såsom primitiva strimma, definitiva endoderm, posterior framtarmen och lever bud stamceller innan de bildar hepatocyte-liknande celler.
Abstract
Levern avgiftar skadliga ämnen, utsöndrar vitala proteiner, och utför viktiga metaboliska aktiviteter, vilket upprätthåller livet. Följaktligen, leversvikt — som kan orsakas av kronisk alkoholintag, hepatit, akut förgiftning, eller andra förolämpningar — är ett allvarligt tillstånd som kan kulminera i blödning, gulsot, koma, och så småningom döden. Emellertid, metoder för att behandla leversvikt, samt studier av leverfunktion och sjukdom, har varit omintetgörs delvis av avsaknaden av ett rikligt utbud av mänskliga leverceller. Detta protokoll specificerar därför en effektiv differentiering av humana pluripotenta stamceller (hPSCs) i hepatocyte-liknande celler, vägledda av en utvecklingsplan som beskriver hur lever ödet specificeras i sex på varandra följande differentierings steg. Genom att manipulera utvecklingsmässiga signalering vägar för att främja levern differentiering och att uttryckligen undertrycka bildandet av oönskade cell öden, denna metod genererar effektivt populationer av mänskliga leverbud stamceller och hepatocyte-liknande celler av dagar 6 respektive 18 i PSC-differentiering. Detta uppnås genom en temporally-exakt kontroll av utvecklingsmässiga signaleringsvägar, som utövas av små molekyler och tillväxtfaktorer i ett serumfritt odlingsmedium. Differentiering i detta system sker i enskiktslager och ger hepatocyte-liknande celler som uttrycker karakteristiska hepatocyte enzymer och har förmågan att att en musmodell av kronisk leversvikt. Förmågan att effektivt generera ett stort antal humana leverceller in vitro har förgreningar för behandling av leversvikt, för läkemedels screening, och för mekanistiska studier av leversjukdom.
Introduction
Syftet med detta protokoll är att effektivt differentiera humana pluripotenta stamceller (hPSCs) till anrikade populationer av lever buds stamledare och hepatocyte-liknande celler2. Tillgång till en färdig försörjning av mänskliga leverprogenitorer och hepatocyte-liknande celler kommer att påskynda arbetet med att undersöka leverfunktion och sjukdom och kan möjliggöra nya cellulära transplantations terapier för leversvikt3,4, 5. Detta har visat sig utmanande tidigare eftersom hPSCs (som omfattar embryonala och inducerade pluripotenta stamceller) kan differentiera till alla cell-typer av människokroppen; Följaktligen har det varit svårt att uteslutande särskilja dem till en ren population av en enda cell-typ, såsom leverceller6.
För att exakt differentiera hPSCs till leverceller, först är det viktigt att förstå inte bara hur leverceller specificeras utan också hur icke-lever cell-typer utvecklas. Kunskap om hur icke-leverceller utvecklas är viktigt att logiskt undertrycka bildandet av icke-lever linjer under differentiering, därmed uteslutande vägleda hPSCs mot en lever öde2. För det andra är det viktigt att avgränsa de flera utvecklings steg genom vilka hPSCs differentierar mot ett lever öde. Det är känt att hpscs sekventiellt differentieras till flera cell-typer som kallas primitiva Streak (APS), definitiva endoderm (de), posterior framtarmen (PFG) och lever bud progenitorer (lb) innan de bildar hepatocyte-liknande celler (HEP). Tidigare arbete avslöjade de signaler som specificerar levern öde och de signaler som undertryckt bildandet av alternativa icke-lever cell-typer (inklusive mage, bukspottkörtel, och intestinal progenitorer) vid varje utvecklingsmässiga Lineage val2, 7 , 8.
Kollektivt, dessa insikter har gett upphov till en serum-fri, enskiktslager metod för att differentiera hpscs mot primitiv strimma, definitiv endoderm, posterior foregut, lever bud progenitorer och slutligen, hepatocyte-liknande celler2. Sammantaget metoden innebär sådd av hpscs i en enskiktslager på en lämplig densitet, förbereda sex cocktails av differentiering media (som innehåller tillväxtfaktorer och små molekyler som reglerar olika utvecklings-signalering vägar), och sekventiellt lägga dessa medier för att inducera differentiering under loppet av 18 dagar. Under processen behövs ingen passaging av celler. Notera, eftersom denna metod uttryckligen omfattar signaler som hämmar bildandet av icke-lever cell-typer, denna differentiering metod1 mer effektivt genererar lever stamceller och hepatocyte-liknande celler i jämförelse med bevarade differentierings metoder2,9,10,11,12. Dessutom möjliggör det protokoll som beskrivs i denna text snabbare generering av hepatocyter som i slutändan uttrycker högre nivåer av levertranskriptionsfaktorer och enzymer än de som produceras av andra protokoll9,10 , elva , 12.
Det protokoll som beskrivs här har vissa fördelar jämfört med aktuella differentierings protokoll. För det första innebär det enskiktslager differentiering av hpscs, vilket är tekniskt enklare jämfört med tredimensionella differentiering metoder, såsom de som förlitar sig på embryoid organ13. För det andra utnyttjar denna metod ett senare förskott varigenom definitiva endoderm-celler (en tidig föregångare till leverceller) effektivt och snabbt kan genereras inom 2 dagar efter hpsc-differentiering på2,7, vilket möjliggör efterföljande produktion av hepatocyter med ökad renhet. För det tredje, i Side-by-side jämförelser, de hepatocyte-liknande celler som produceras av denna metod2 producerar mer albumin och uttrycker högre nivåer av levertranskriptionsfaktorer och enzymer jämfört med hepatocyter som produceras på andra metoder10, 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod möjliggör generering av anrikade populationer av lever bud progenitorer, och därefter hepatocyte-liknande celler, från hPSCs. Förmågan att generera berikade populationer av mänskliga leverceller är viktigt för den praktiska användningen av sådana celler. Tidigare metoder för att generera hepatocyter från hPSCs gav oren cellpopulationer som innehåller både lever och icke-leverceller som, vid transplantation till gnagare, gav Ben och brosk förutom levervävnad15. Därför…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Bing lim för diskussioner och Stanford Institutet för stamcellsbiologi & regenerativ medicin för infrastrukturstöd. Detta arbete stöddes av California Institute for Regenerative Medicine (DISK2-10679) och Stanford-UC Berkeley Siebel Stem cell Institute (till L.T.A. och K.M.L.) och Stanford Beckman Center för molekylär och genetisk medicin samt den anonyma, Baxter och DiGenova familjer (till K.M.L.).
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
- Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
- Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
- Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
- Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
- Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
- Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
- Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
- Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
- Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).
