여기에서 우리는 심혼에 있는 심실 광학 카테터를 심장 벽을 가로질러 흡광도 분광학을 능력을 발휘하기 위하여 공류된 심혼에 이용하는 방법을 소개합니다. 얻은 데이터는 조직 산소 장력뿐만 아니라 기질 활용 및 멤브레인 잠재력에 대한 강력한 정보를 이 유비쿼터스 제제에서 심장 성능 측정과 동시에 제공합니다.
심장 근육의 흡광도 분광법은 각각 미오글로빈과 시토크롬 흡광도를 통해 세포증 및 미토콘드리아 산소화에 대한 비파괴적 평가를 제공합니다. 또한, 막 전위 및 기질 진입과 같은 미토콘드리아 대사 상태의 수많은 양상도 추정될 수 있다. 심장 벽 투과 광학 분광법을 수행하기 위해, 시판되는 측면 발사 광섬유 카테터는 광원으로서 단경된 교좌의 좌심실에 배치된다. 심장벽을 통과하는 빛은 거의 실시간으로 심장의 광학 분광법을 수행하기 위해 외부 광섬유로 수집됩니다. 투과 방식은 널리 사용되는 반사 접근 방식에서 발생하는 수많은 표면 산란 간섭을 방지합니다. 교란 흡광도 스펙트럼의 변화는 발색단 기준 스펙트럼의 라이브러리를 사용하여, 동시에 알려진 모든 심장 염색체의 정량적 측정을 제공, deconvvolved했다. 이 스펙트럼 데코볼루션 접근법은 중첩된 흡광도 스펙트럼에 적용되는 일반적인 이중 파장 방법을 사용하여 발생할 수 있는 본질적인 오류를 제거하고 적합성의 장점을 정량화하여 평가했습니다. 사용자 지정 프로그램은 데이터 수집 및 분석을 위해 설계되었으며, 이를 통해 조사자가 실험 중에 준비의 대사 상태를 모니터링할 수 있었습니다. 표준 심장 관류 시스템에 이러한 비교적 간단한 추가 수축, 관류 및 기질 /산소 추출의 전통적인 측정 뿐만 아니라 심장 벽의 대사 상태에 독특한 통찰력을 제공 합니다.
그대로 기관 생화학을 모니터링하기위한 광학 흡광도 분광법은 본질적, 비파괴적 특성1,2,3,4,5로인해 널리 사용되는 접근 법입니다. 6,7,8,9. 미오글로빈 흡광도는 평균 세포산소장력10,11,12의척도를 제공한다. 미토콘드리아 시토크롬은 플라빈 수준에서 기질 진입에 관한 정보를 제공하며, 시토크롬 b L:bH13에서막 전위, 세포내 미토콘드리아로의 산소 전달(COX) ) 레독스 상태14. Glancy 외. 각 복합체의 활동은 미토콘드리아 막 전위 및 대사율15를측정하여 결정될 수 있음을 입증하였다. 따라서 광학 분광법을 사용하면 외인성 프로브나 현재 연구 시스템의 주요 수정 없이도 풍부한 정보를 얻을 수 있습니다. 이 논문의 목적은 어두운 환경에서 연구를 수행하는 유일한 주요 변형과 기존의 관공 심장 제제에서 전송 광학 스펙트럼을 수집하기위한 강력한 방법을 제시하는 것입니다.
반사 흡수 분광법은 성공적으로 뿐만 아니라 관이 심장 의 광학 분광법을 수행하는 데 사용되었습니다 3, 6,6,16,17,18,19뿐만 아니라 생체 내 의 심장으로1. 반사 분광법은 심장 표면에 빛을 충돌하고 심장을 통해 흩어져있는 빛을 수집하는 것뿐만 아니라 확산 및 반사 반사 광으로 구성됩니다. 따라서, 이러한 접근법에서 수집된 빛은 관심있는 조직 발광광뿐만 아니라 다중 산란 메커니즘의 복합체이다. 심장의 움직임과 복잡한 표면으로 인해 심장 표면에서 반사되는 빛은 특히 문제가 되어 침투 깊이와 순수하게 반사된 빛의 양을 변경합니다.
상기 제시된 반사흡수분광학의 한계는 좌심실 캐비터내로 광학카테터를 도입하여, 좌심실 자유벽(20)을 가로질러 투과된 빛의 수집을 허용함으로써 해결되었다. 이러한 유형의 연구에 대한 전송 분광법의 이점은 Tamura et al.9에 의한 초기 침습 연구에서 평가되었습니다.9 현재 구현은 손상되지 않은 심장의 매우 강력한 전송 흡수 분광학 분석을 제공합니다. 다양한 조건하에서 세포산산화 및 미토콘드리아 레독스 상태에 관한21. 이러한 초기 연구는 심근을 통해 백색광의 측면 발사 패턴을 생성하기 위해 팁 지향에 전원 LED가있는 특수 제작 된 카테터를 사용했습니다. 그러나 상대적으로 큰 LED 팁 카테터는 중간 크기의 하트 (토끼, 기니 피그 등)에 사용하기에만 적합하며 사용자 정의 제작이 필요합니다. 현재 연구에서는, 광 가이드로서 시판되는 200 미론 코어 측 발사 광섬유를 사용하는 방법이 제시된다. 팁의 유선 LED 대신 500마이크로 팁이 있는 카테터는 외부 소스의 빛을 리디렉션하여 시스템의 다기능성을 높입니다. 이 접근법은 라만 산란 분광법과 같은 응용 분야에 레이저를 포함한 다양한 외부 광원을 사용할 수 있게 합니다. 이 데이터를 정량화하기 위해, 심장 크로모포어의 분광 측정의 정확도를 향상시키기 위해 공지된 기준 분광을 이용한 온라인 전체 다성분 분광 분석은 앞서 설명한 바와 같이 제시된다20,22. 이 분석에 대한 소스 코드는 요청 시 작성자가 제공합니다. 이 접근법을 사용하여 심장 생화학 및 미토콘드리아 기능에 대한 정보는 심장 제제에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 기존의 심장 기능 파라미터와 동시에 얻을 수 있습니다. 심장은 미토콘드리아 기능과 산소 전달에 크게 의존하기 때문에, 고전적인 공복 심장 시스템에 이 기술적 추가는 심장 성능의 이 중요한 모형의 해석 그리고 유용성을 크게 향상할 것입니다.
고립 된 역행 또는 작동 관류 심장 준비는 심장 생리학의 연구뿐만 아니라 심장에 기술과 약물의 전임상 조사의 주류입니다. 그것의 사용의 열쇠는 준비의 용이성, 강력한 기능적 특성 및 실험 적 매개 변수의 제어뿐만 아니라 박동 심장의 많은 기능적 매개 변수를 측정 할 수있는 능력이었다. 광학 흡광도 분광법은 미토콘드리아 대사 활동뿐만 아니라 조직 산소화에 대한 통찰력을 제공합니다. 광학 분광법은 주로 움직임과 광 산란 합병증으로 인해 해석하기 어려운 반사 모드에서 분리된 투과 심장 연구에서 수행되었습니다.
우리는 심장 조직 신진 대사 염색체를 모니터링하는 강력한 방법을 제공하기 위해 심실 벽 전달 광학 분광법 (VWTOS)을 도입했습니다. 이전 간행물에서, 우리는 동축 케이블(20)의 끝에 유선 LED가 VWTOS 퍼퓨즈 하트에 사용할 수있는 독특한 심장 내 측면 발사 광원을 만든다는 것을 입증했다. 측면 소성은 카테터의 긴 축에 수직으로 빛의 투영을 말하며, 심실 없는 벽을 조명하는 데 이상적입니다. LED 카테터는 심장 기능에 영향을 미치지 않을 정도로 작지만 실험실에서 특수 제작이 필요했습니다. 현재 연구는 광섬유와 호환되는 모든 광원에 결합 될 수있는 500 미크로네의 상용 측면 발사 카테터의 사용을 제시한다. 이러한 측면 발사 광학 카테터는 섬유의 긴 축에 수직으로 레이저 절제용으로 상업적으로 개발되었다. 당연히 광도화에 필요한 것보다 훨씬 낮은 광전력을 사용하고 있습니다. 더 작은 섬유는 패복 마우스 심장(27)과같은 더 작은 제제에 사용할 수 있다. 이 광섬유 시스템은 심장 염색체가 흡수하는 파장 범위의 심장 벽을 통해 적절한 조명을 제공했습니다 (450-630 nm). 심장 의 외부에 픽업 광섬유를 사용하여, 미오글로빈과 미토콘드리아 시토크롬의 흡광도는 우수한 시간 및 스펙트럼 분해능으로 모니터링 할 수 있습니다 (그림 5참조). 측면 소성 광섬유 접근법은 심장에 카테터의 충격을 최소화하는 카테터의 훨씬 작은 단면 프로파일을 포함하여 VWTOS용 LED 카테터에 비해 몇 가지 장점이 있으며, 심장 판막에 미치는 영향을 보다 유연하게 감소시키고 심실 성능, 식염수 에서 단락 할 수있는 전기 적 연결이 없으며 마지막으로 VWTOS의 광원 선택의 유연성을 증가시키는 외부 광원을 사용하는 카테터.
490 nm 이하의 심장의 강한 흡광도로 인해 340 nm에서 410-445 nm 또는 NADH 의 영역에서 시토 크롬의 소레트 밴드에 많은 정보를 생성하기가 어렵습니다. 따라서, 450 nm에서 FAD의 넓은 흡광도는 관찰되는 가장 낮은 주파수 흡광도이지만, 이 크로모포레스의 전체 흡수 피크는 샘플링되지 않는다. VWTOS를 사용하여 전체 벽이 표면 반사 분광법과 대조적으로 샘플링되기 때문에 신호 대 잡음 비율이 매우 높으며, 일반적으로 사용되는20은수많은 산란 문제로 심장 표면을 샘플링합니다. 전체 심장 벽을 샘플링하는 VWTOS는 31P와 같은 많은 심장 대사 산물의 핵 자기 공명 분광법 (NMRS) 측정과 더 유사하다 아데노신 삼인산과 크레아틴 인산염28, 13C 검출 표지된 대사산물29, 30[31]31,32,1H 검출대사산물33. VWTOS는 비자기 장치를 사용하여 수행 될 수 있기 때문에 NMR과 VWTOS가 동시에 수행 될 수 있다는 것은 완전히 가능합니다. VWTOS는 내인성 크로모포에 국한되지 않으며 pH,Ca2+및 플라즈마 멤브레인 전위를 위한 광학 프로브로부터의 흡수를 모니터링하는 데 사용될 수 있습니다.
우리는 노이즈에 우수한 단일 스펙트럼 신호를 제공하는 2 Hz (즉, 2 샘플 / 초)를 사용합니다. 더 높은 샘플링 속도는 심장 주기 분석을 허용하는 달성될 수 있더라도, 이전 연구 결과는 염색체 흡광도에 있는 변이를 이길 이길 이길 이길 이의 여지가 없다는 것을 보여주었습니다, 그래서 심장 주기의 함수로 선택적으로 빛을 수집하는 아무 노력도 없었습니다 만든34. VWTOS 기하학으로 인해 복잡한 표면 산란 이벤트가 제거되기 때문에 빛의 검출은 반사 방법보다 조직 운동에 덜 의존합니다. 우리는 가혹한 운동이 이 측정을 중단할 수 있다는 것을 것을을 발견합니다, 그러나 실시간 스펙트럼 분석은 조직 염색체 전이와 일치하지 않는 스펙트럼 전이를 빨리 제시합니다. 다시 말하지만, 이것은 심장이 수집 섬유에서 심하게 멀리 움직일 때만 발생하며 수집된 투과된 빛의 양을 극적으로 감소시킵니다.
VWTOS 데이터는 앞서 설명한 바와 같이 심장 크로모포의 스펙트럼 및 광원의 스펙트럼의 참조 라이브러리를 기반으로 전체 스펙트럼 피팅 루틴을 사용하여분석20,22,27, 35는 간단한 선형 최소 제곱 접근 방식입니다. 이 스펙트럼 피팅 절차는 겹치는 흡광도 스펙트럼을 보상하고 “등이 대”파장에 의존하지 않습니다. 이 전체 스펙트럼 분석은 일반적인 이중 빔(즉, 2개의 파장)분석 1,3,6과 관련된 아티팩트를 제거하며, 이는 문제가 있는20으로나타났습니다. 전체 스펙트럼 해석의 추가 적인 장점은 이중 빔 프로토콜에서 사용할 수 없는 잔차에서 적합의 생성입니다.
이 연구에서는 시안화물이 심장의 광학적 특성에 미치는 영향에 중점을 두어 왔습니다. 시안화물블록으로 시토크롬 산화효소는 산소 소비를 억제하고 본질적으로 모든 시토크롬의 순 감소를 초래하며, 전자가 시토크롬 사슬에서 백업됨에 따라 모든 시토크롬의 순 감소를 초래합니다. 그러나, 멤브레인 잠재력은 분명히 높게 남아, bL 및 bH의 산화환원 변화는 시토크롬 c13에비해 매우 작기 때문에. 산소 소비의 중단으로, 조직에 있는 산소 긴장은 향수에 접근해야 하고 우리는 식염수 가 심장을 관념과 일치하는 시안화물로 산소화된 myoglobin에 있는 초기 증가를 주의했습니다, 역행 관류에서조차 모드는 시토졸19,20,21,36에서미오글로빈을 완전히 산소화하지 않습니다. 산소화 된 미오글로빈에 대한 시안화물의 최대 효과를 허혈로 얻은 완전히 탈산소 스펙트럼과 비교하면 이전 연구와 일치하는 약 88 %의 미오글로빈 산소가 밝혀졌습니다.
이 연구에서 는 미오글로빈 산소화 및 시토크롬 감소에 대한 시안화물 효과가 일시적으로 해결되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 시안화물의 효과가 먼저 관상 동맥 흐름과 미오글로빈에서 관찰된 후 심장의 시토크롬 산화반소 상태의 큰 변화가 관찰되었다는 것은 놀라운 사실입니다. 흐름의 초기 현저한 증가는 심장 세포에서 총 대사 효과가 관찰되기 전에 동맥 평활근24,37에 대한 효과가 발생할 수 있음을 시사한다. 흐름의 증가, 잠재적으로 겸손한 시안화물 유도 호흡의 감소, 가능성이 산소 전달의 증가에 의해 발생 된 산소화 myoglobin의 즉각적인 증가 결과. 시안화물 억제가 근세포에 확산되면서 관상 동맥 흐름의 추가 증가가 관찰됩니다(도 5에서3으로 표시된 영역 참조), 수많은 대사 인자38에의해 구동될 가능성이 있다. 흐름에 시안화물의 큰 초기 영향은 혈관 평활근의 대사가 근세포의 대사보다 혈관 톤을 변경하는 데 더 강력 할 수 있음을 시사한다. 이러한 데이터는 미오글로빈이 미토콘드리아 레독스 상태의 변화 이전에 잘 발생했기 때문에, 그대로 심장에서도 COX보다 산소에 대한 친화력이 훨씬 낮다는 잘 확립된 개념을 뒷받침한다(그림 5). 제어 조건하에서 탈산소된 미오글로빈의 이 높은 수준은 단리된 식염수 관류가 통제 조건 하에서도 부분적으로 저산소일 수 있음을 시사하는 이전 연구와 일치한다9,19, 20,21,27,36, 심장 생리학에서이 중요한 모델을 사용할 때 심장 조직 산소 화 모니터링의 중요성을 강조합니다.
우리는 여기에서 고립된 관능된 심혼에 전송 흡수 분광학을 수행하기 위한 실험적인 세부사항을 제시합니다. 우리는 성공적으로 얇은 측면 발사 심장 내 광섬유를 사용하여 마우스에 토끼에서 마음에 사용하기 위해이 기술을 적응했다. 최첨단 전체 스펙트럼 피팅 루틴을 활용하여, 심장 크로모포어의 복잡한 광학 상호 작용은 종래와 동시에 심근 대사의 중요한 요소의 거의 실시간 측정 제공, 쉽게 추출 될 수있다 기능 적 조치.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NHLBI 교내 프로그램 (프로젝트 # ZIA HL00460131)에 의해 완전히 지원되었습니다.
BIOPAC data acquisition system | BIOPAC | MP150 | Analog to digitial conversion |
BIOPAC general purpose transducer amplifiers | BIOPAC | DA100C | Pressure monitoring |
BIOPAC System skin temperature amplifier | BIOPAC | SKT100B | temperature monitoring |
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers | Mightex | SLC-MA02-U | External light source power supply |
Disposable pressure sensors | BIOPAC | RX104A | Pressure monitoring |
Dual Syringe, Infusion Pump | KdScientific | KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP | drug injection |
Flow-through probes | Transonic | 4PXN | perusate flow monitoring |
Glass Syringe | FORTUNA Optima | 30 CC | Air tight fluid injection |
High power fiber-coupled LED white light source | Mightex | Type-A FCS-0000 | External light source |
Perfused heart system | Radnoti | 120101BEZ | This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript) |
Phase fluorimeter | Ocean Optics | NeoFox-GT | oxygen concentration |
Pickup fiber optic | Thor labs | BF20HSMA01 | Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber) |
PowerLab unit | AD Instruments | PowerLab 8/35 | Analog to digitial conversion |
Pressure transducers | BIOPAC | TSD104A | pressure monitoring |
Programming environment | LABViEW | N/A | Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request |
Rapid scanning spectrophotometer | Ocean Optics | QE65PRO | Rapid scanning spectrometer for spectral analysis |
Side firing fiber optic | Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 | JTFLH200230500/1.5M | side firing fiber optic 200 microns core |
Sodium cyanide | Sigma-Aldrich | 380970 | Metabolic inhibitor |
Temperature probe | BIOPAC | TSD102A | temperature monitoring |
Tubing flow modules | Transonic | TS410 | perusate flow monitoring |