在这里,我们介绍一种方法,在注入的心脏中使用心内光学导管,以执行跨越心壁的吸光光谱。获得的数据提供了关于组织氧张力以及基质利用和膜电位的可靠信息,同时提供这种无所不在的制备中心脏性能测量。
心肌吸收镜光谱分别通过肌红蛋白和细胞色素吸收提供细胞体和线粒体氧合的无损评估。此外,还可以估计线粒体代谢状态的许多方面,如膜电位和基板进入。为了执行心壁传输光学光谱,一个市售的侧射光纤导管被放置在隔离的渗透心脏的左心室作为光源。穿过心壁的光用外部光纤收集,以近乎实时地对心脏进行光学光谱。传输方法避免了在广泛使用的反射方法中出现的大量表面散射干扰。使用色度参考光谱库对透膜吸收光谱的变化进行解测,同时提供所有已知心脏色镜的定量测量。这种光谱去卷积方法消除了使用适用于重叠吸收光谱的通用双波长方法可能导致的内在误差,并提供了拟合优度定量评估。设计了一个用于数据采集和分析的定制程序,使研究者能够监测实验期间制剂的代谢状态。除了传统的收缩、灌注和基质/氧气提取措施外,标准心脏灌注系统的这些相对简单的添加提供了对心脏壁代谢状态的独特见解。
光学吸光光谱用于监测完整的器官生物化学是一种广泛使用的方法,由于其内在的、非破坏性的性质1,2,3,4,5 6,7,8,9.肌红蛋白吸收率提供平均细胞氧张力10,11,12的测量。线粒体细胞色素提供有关基质进入水平的信息,细胞色素bL:bH13的膜电位,以及细胞色素氧化酶(COX)向细胞内线粒体输送的氧气) 氧化还原状态14。Glancy等人证明,通过测量线粒体膜电位和代谢率15可以确定每个复合物的活动。因此,使用光学光谱学,无需外源探测或对当前研究系统进行重大修改,即可获得大量信息。本文的目标是提出一种在传统的渗透心脏制剂中收集透射光光谱的可靠方法,唯一的重大修改是在黑暗的环境中进行研究。
反射吸收光谱已成功用于执行透水心脏3、6、16、17、18、19的光学光谱。作为心脏在体内1。反射光谱包括冲击心脏表面的光,收集散落在心脏的光以及漫反射和镜面反射光。因此,该方法中收集的光是多种散射机制以及感兴趣的组织色度吸收的复合体。由于心脏的运动和复杂的表面,心脏表面的光反射特别成问题,改变了穿透深度和纯反射光的量。
通过将光学导管引入左心室腔,允许在左心室自由壁20上收集透射光,解决了上述反射吸收光谱的局限性。在 Tamura 等人的早期侵入性研究中,对此类研究的传输光谱学的好处表示赞赏。关于细胞氧合和线粒体氧化还原状态在各种条件下21。这些初步研究使用特制的导管,尖端带有带电源的LED,通过心肌产生白光的侧射模式。然而,相对较大的LED倾动导管只适用于中型心脏(兔子,豚鼠等),需要定制制造。在目前的研究中,提出了一种使用市售的200微米芯侧燃光纤作为光导的方法。具有 500 微尖端的导管将光线从外部源重定向,而不是尖端的有线 LED,从而提高了系统的多功能性。这种方法允许使用各种外部光源,包括激光器,用于拉曼散射光谱等应用。为了量化这些数据,使用已知参考光谱进行在线全多组分光谱分析,以提高心脏色镜光谱测定的准确性,如前述20、22所述。此分析的源代码将由作者应要求提供。使用这种方法,心脏生物化学和线粒体功能的信息可以同时获得与传统的心脏功能参数,很少或没有影响心脏准备。由于心脏严重依赖线粒体功能和氧气输送,这种技术补充的经典注入心脏系统将大大提高这一重要心脏性能模型的解释和效用。
孤立的逆行或工作渗透心脏制剂是心脏生理学研究以及心脏技术和药物的临床前研究的支柱。其使用的关键是制备方便,功能特性强,对实验参数的控制,以及测量跳动心脏的许多功能参数的能力。光学吸收光谱提供对组织氧合以及线粒体代谢活动的洞察。光学光谱学主要在反射模式下的隔离透射心脏研究中进行,由于运动和光散射并发症,这些研究很难解释。
我们引进了心室壁透射光学光谱(VWTOS),为监测心脏组织代谢色球提供了可靠的方法。在以前的出版物中,我们演示了连接到同轴电缆20尖端的 LED 可制造独特的心内侧射光源,可用于 VWTOS 注入心脏。侧射是指垂直于导管长轴的光的投影,是照亮心室自由壁的理想选择。LED 导管足够小,不会影响心脏功能,但需要在实验室进行专门制造。目前的研究提出了使用500微米商业侧射导管,可以耦合到任何与光纤兼容的光源。这些侧射光学导管是为垂直于光纤长轴的激光消融而开发的。当然,我们使用的光功率比光消融所需的低得多。较小的纤维可用于较小的制剂,如注入小鼠心脏27。该光纤系统在心脏色球吸收(450–630 nm)的波长范围内通过心脏壁提供足够的照明。使用心脏外侧的拾取光纤,可以用出色的时间和光谱分辨率监测肌红蛋白和线粒体细胞色素的吸收率(见图5)。 与 VWTOS 的 LED 导管方法不同,侧燃光纤方法具有多种优势,包括导管的横截面轮廓更小,可最大限度地减少导管对心脏的影响,更灵活地减少对心脏瓣膜的影响,心室性能,没有可在盐水渗透中短路的电气连接,最后是使用外部光源的导管,增加了 VWTOS 光源选择的灵活性。
由于心脏的吸光性强于490nm以下,因此很难在410-445nm区域或340nm处产生关于细胞色素的索雷带的信息。因此,在 450 nm 处,FAD 的宽吸收率是观察到的最低频率吸收率,尽管未对该色光的整个吸收峰值进行采样。使用VWTOS,信号噪声比非常高,因为整个壁的采样与表面反射光谱,通常使用的20,只有采样心脏表面与大量的散射问题。VWTOS采样整个心脏壁更类似于核磁共振光谱(NMRS)测量的许多心脏代谢物,如31P检测到三磷酸腺苷和肌酸磷酸28,13C检测标记代谢物29,30包括超极化标签31,32和1H检测代谢物33。由于 VWTOS 可以使用非磁性器件进行,因此可以同时进行 NMR 和 VWTOS 是完全可行的。VWTOS不限于内源色谱,可用于监测光学探针对pH、Ca2+和等离子膜电位的吸收。
我们使用 2 Hz(即 2 个采样/秒),为噪声提供出色的单频谱信号。虽然可以达到更高的采样率,允许心脏周期分析,以前的研究已经表明,没有节拍击败染色体吸收的变化,所以没有努力有选择地收集光作为心脏周期的功能做了34。由于 VWTOS 几何形状,光的检测对组织运动的依赖程度低于反射方法,因为消除了复杂的表面散射事件。我们发现,剧烈运动会破坏这些措施,但实时光谱分析快速揭示出与组织色度过渡不一致的光谱过渡。同样,只有当心脏严重远离收集纤维时,才会发生这种情况,从而大大减少收集的透射光量。
VWTOS 数据使用基于心脏色谱光谱和光源光谱的参考库(如前面描述的20、22、27 ) 进行全光谱拟合例程分析。 35与简单的线性最小二乘方法。这种光谱拟合程序弥补了重叠的吸光度谱,不依赖于”等位”波长。这种全谱分析消除了与常见的双光束(即两个波长)分析1,3,6相关的伪影,这已被证明是有问题的20。全光谱分析的附加优势是从残差中生成拟合优,在双光束协议中是不可用的。
在这项研究中,我们重点研究了氰化物对心脏光学特性的影响。当氰化物阻止细胞色素氧化酶时,它抑制耗氧量,并从根本上导致所有细胞色素的净减少,因为电子在细胞色素链中备份。然而,膜电位显然仍然很高,因为与细胞色素c13相比,bL和bH中的氧化还原变化非常小。随着氧气消耗的停止,组织中的氧张力应接近渗透液,我们注意到含氧肌红蛋白与氰化物的早期增加,这与盐水灌注心脏,即使在逆行灌注中,也符合这一概念。模式,没有完全氧化肌红蛋白在细胞醇19,20,21,36。将氰化物对含氧肌红蛋白的最大影响与缺血所得的完全脱氧光谱进行比较后发现,肌红蛋白的氧合率仅为88%左右,与以前的研究一致。
在这项研究中,必须注意氰化物对肌红蛋白氧合和细胞色素减少的影响是暂时性的。令人惊讶的是,在观察到心脏细胞色素氧化还原状态发生巨大变化之前,首先观察到氰化物对冠状动脉和肌红蛋白的影响。早期明显增加的流量表明,在观察到心脏细胞的代谢效应之前,可能对动脉平滑肌24、37产生影响。流量的增加,可能与适度的氰化物诱导呼吸减少,可能导致氧气输送增加引起的立即增加的含氧肌红蛋白。随着氰化物抑制扩散到肌细胞,冠状动脉流动进一步增加(参见图5a中标出的区域3),可能受众多代谢因子38的驱动。氰化物对流动的早期影响很大,表明血管平滑肌的代谢可能比肌细胞的代谢更有力地改变血管张力。这些数据支持了一种公认的观念,即肌红蛋白对氧的亲和力比COX低得多,即使在完整的心脏中也是如此,因为肌红蛋白氧合早在线粒体氧化原状态改变之前就发生了(图5)。这种在控制条件下的高脱氧肌红蛋白水平与先前的研究表明,即使在控制条件下,孤立的盐水渗透心脏也可能部分缺氧。 20,21,27,36,强调了监测心脏组织氧合的重要性,当使用这个重要的模型在心脏生理学。
我们在这里介绍在隔离的渗透心脏上进行透射吸收光谱的实验细节。我们已经成功地将这项技术用于从兔子到小鼠的心脏,通过使用一个薄的侧射心脏内光纤。利用最先进的全光谱配合程序,可以轻松提取心脏色谱的复杂光学相互作用,与传统心肌代谢的关键元素同时进行近实时测量功能措施。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了NHLBI校内计划(项目+ZIA HL00460131)的全力支持。
BIOPAC data acquisition system | BIOPAC | MP150 | Analog to digitial conversion |
BIOPAC general purpose transducer amplifiers | BIOPAC | DA100C | Pressure monitoring |
BIOPAC System skin temperature amplifier | BIOPAC | SKT100B | temperature monitoring |
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers | Mightex | SLC-MA02-U | External light source power supply |
Disposable pressure sensors | BIOPAC | RX104A | Pressure monitoring |
Dual Syringe, Infusion Pump | KdScientific | KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP | drug injection |
Flow-through probes | Transonic | 4PXN | perusate flow monitoring |
Glass Syringe | FORTUNA Optima | 30 CC | Air tight fluid injection |
High power fiber-coupled LED white light source | Mightex | Type-A FCS-0000 | External light source |
Perfused heart system | Radnoti | 120101BEZ | This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript) |
Phase fluorimeter | Ocean Optics | NeoFox-GT | oxygen concentration |
Pickup fiber optic | Thor labs | BF20HSMA01 | Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber) |
PowerLab unit | AD Instruments | PowerLab 8/35 | Analog to digitial conversion |
Pressure transducers | BIOPAC | TSD104A | pressure monitoring |
Programming environment | LABViEW | N/A | Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request |
Rapid scanning spectrophotometer | Ocean Optics | QE65PRO | Rapid scanning spectrometer for spectral analysis |
Side firing fiber optic | Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 | JTFLH200230500/1.5M | side firing fiber optic 200 microns core |
Sodium cyanide | Sigma-Aldrich | 380970 | Metabolic inhibitor |
Temperature probe | BIOPAC | TSD102A | temperature monitoring |
Tubing flow modules | Transonic | TS410 | perusate flow monitoring |