बोन रीमॉडलिंग को मापने और Calvaria सह संस्कृति और हिस्टोमोर्पोमेट्री का उपयोग कर ट्यूमर हड्डी माइक्रोएनवायरमेंटल पुनः बनाने
Summary
हड्डी explants की पूर्व वीवो संस्कृति हड्डी शरीर विज्ञान के अध्ययन और हड्डी रीमॉडलिंग और हड्डियों के रोगों में दवाओं के संभावित मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल नवजात चूहों खोपड़ी से अलग calvarias की तैयारी और संस्कृति का वर्णन करता है, साथ ही साथ इसके अनुप्रयोगों ।
Abstract
हड्डी ऑस्टियोब्लास्ट, ऑस्टियोसाइट्स, और ऑस्टियोप्लास्ट और एक खनिज बाह्य मैट्रिक्स का गठन किया गया एक संयोजी ऊतक है, जो इसे अपनी ताकत और लचीलापन देता है और इसे अपने कार्यों को पूरा करने की अनुमति देता है। हड्डी लगातार उत्तेजनाओं की एक किस्म है, जो रोग की स्थिति में हड्डी remodeling नियंत्रण मुक्त कर सकते है के संपर्क में है । हड्डी जीव विज्ञान और रोगों का अध्ययन करने और संभावित चिकित्सीय एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए, इन विट्रो और वीवो मॉडल में विकसित करना आवश्यक हो गया है।
यह पांडुलिपि हड्डी के गठन और बोन ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट का अध्ययन करने के लिए नवजात चूहों से अलग calvarias की विच्छेदन प्रक्रिया और संस्कृति की स्थिति का वर्णन करती है। इन विट्रो और वीवो मॉडल ों के विपरीत, यह पूर्व वीवो मॉडल वांछित माइक्रोएनवायरमेंट को अनुकरण करने के लिए परिभाषित परिस्थितियों में विविधता करते हुए ऊतक के त्रि-आयामी वातावरण के साथ-साथ हड्डी की सेलुलर विविधता के संरक्षण की अनुमति देता है। इसलिए, बोन रीमॉडलिंग और इसके तंत्र की जांच करना संभव है, साथ ही अन्य सेल प्रकारों के साथ बातचीत, जैसे कैंसर कोशिकाओं और हड्डी के बीच बातचीत।
यहां रिपोर्ट किए गए परखों में 5-7 दिन पुराने बीएएलएलबी/सी चूहों से कैलवेरिया का इस्तेमाल किया गया है । प्राप्त हेमी-कैलवेरिया इंसुलिन, स्तन कैंसर कोशिकाओं (एमडीए-एमबी-231) या स्तन कैंसर कोशिका संस्कृतियों से वातानुकूलित माध्यम की उपस्थिति में सुसंस्कृत हैं। विश्लेषण के बाद, यह स्थापित किया गया था कि इंसुलिन ने नई हड्डी के गठन को प्रेरित किया, जबकि कैंसर कोशिकाओं और उनके वातानुकूलित मध्यम प्रेरित हड्डी अवशोषण। अस्थि विकास और कैंसर से प्रेरित हड्डियों की बीमारियों का अध्ययन करने के लिए बुनियादी और लागू अनुसंधान में कैल्वरियाल मॉडल का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। कुल मिलाकर, यह एक आसान, जानकारीपूर्ण और कम लागत वाली परख के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प है।
Introduction
हड्डी एक गतिशील संयोजी ऊतक है जिसमें मांसपेशियों का समर्थन करने, आंतरिक अंगों और अस्थि मज्जा की रक्षा करने और कैल्शियम और विकास कारकों को संग्रहित करने और जारी करनेसहित,कई कार्यहैं। इसकी अखंडता और उचित कार्य को बनाए रखने के लिए, हड्डी ऊतक लगातार रीमॉडलिंग की प्रक्रिया के तहत है। सामान्य शब्दों में, हड्डी पुनर्मॉडलिंग के एक चक्र को हड्डी अवशोषण और हड्डी गठन1में विभाजित किया जा सकता है। हड्डी रीमॉडलिंग के इन दो चरणों के बीच एक असंतुलन हड्डी विकृतियों के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसके अलावा, स्तन कैंसर जैसी बीमारियां अक्सर हड्डी अखंडता को प्रभावित करती हैं; उन्नत चरणों में लगभग 70% से अधिक रोगियों के पास हड्डी मेटास्तासेस होंगे या होंगे। जब स्तन कैंसर की कोशिकाएं हड्डियों में प्रवेश करती हैं, तो वे अस्थि चयापचय को प्रभावित करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक अवशोषण (ऑस्टियोप्लास्टिक घाव) और/या गठन (ऑस्टियोब्लास्टिक घाव)3।
हड्डियों की बीमारियों के जीव विज्ञान को समझने और नए उपचार विकसित करने के लिए, हड्डी रीमॉडलिंग में शामिल तंत्र को समझना आवश्यक है। कैंसर रिसर्च में बोन मेटास्टैसिस प्रोसेस और मेटास्टैटिक माइक्रोएनवायरमेंट से इसके रिलेशन की जांच करना जरूरी है । 1889 में, स्टीफन पेजेट ने परिकल्पना की कि मेटास्टेस तब होती है जब ट्यूमर कोशिकाओं और लक्ष्य ऊतकों के बीच अनुकूलता होती है, और सुझाव दिया जाता है कि मेटास्टैटिक साइट माइक्रोएनवायरमेंट4के लिए ट्यूमर की आत्मीयता पर निर्भर करती है। 1 99 7 में, मुंडी और आड़ ने “हड्डी मेटाटैस के दुष्चक्र” की अवधारणा को पेश किया ताकि यह समझा जा सके कि ट्यूमर कोशिकाएं अपने अस्तित्व और विकास को प्राप्त करने के लिए अस्थि सूक्ष्मवातावरण को कैसे संशोधित करती हैं, और कैसे अस्थि सूक्ष्मवातावरण कैल्शियम और विकास कारक5,6,6,7प्रदान करके उनके विकास को बढ़ावा देता है।
हड्डी के पुनर्मॉडलिंग और हड्डी मेटास्टेसिस में शामिल तंत्र की विशेषता और संभावित चिकित्सीय क्षमता के साथ अणुओं का मूल्यांकन करने के लिए, यह विट्रो में और वीवो मॉडल में विकसित करने के लिए आवश्यक हो गया है । हालांकि, ये मॉडल वर्तमान में कई सीमाएं पेश करते हैं, जैसे हड्डी माइक्रोएनवायरमेंट का सरलीकृत प्रतिनिधित्व, और उनकी लागत8,,9। हड्डी explants पूर्व वीवो की संस्कृति को त्रि-आयामी संगठन के साथ-साथ हड्डी कोशिकाओं की विविधता को बनाए रखने का लाभ है। इसके अलावा प्रायोगिक परिस्थितियों को नियंत्रित किया जा सकता है। एक्सप्लांट मॉडल में मेटाट्रासल हड्डियों, ऊर्ध्वाधर सिर, कालवेरिया, और मंडीबुलर या ट्रैबरकुलर कोर10की संस्कृति शामिल है। पूर्व वीवो मॉडल के फायदे विविध अध्ययनों में प्रदर्शित किए गए हैं। 2009 में, नॉर्डस्ट्रैंड और सहयोगियों ने हड्डी और प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं11के बीच बातचीत के आधार पर एक सहसंस्कृति मॉडल की स्थापना की सूचना दी। इसके अलावा, 2012 में, कर्टिन और सहयोगियों ने पूर्व वीवो सहसंस्कृतियों12का उपयोग करके त्रि-आयामी मॉडल के विकास की सूचना दी। इस तरह के पूर्व वीवो मॉडल का उद्देश्य हड्डी माइक्रोएनवायरमेंट की स्थितियों को यथासंभव सही तरीके से फिर से बनाना है ताकि सामान्य या रोग हड्डी रीमॉडलिंग में शामिल तंत्र को चित्रित करने और नए चिकित्सीय एजेंटों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने में सक्षम हो सके।
वर्तमान प्रोटोकॉल गैरेट13 और मोहम्मद एट अल14द्वारा प्रकाशित प्रक्रियाओं पर आधारित है । नवजात माउस कैल्वेरिया संस्कृतियों को एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है, क्योंकि वे विकास और हड्डी कोशिकाओं के तहत हड्डी के त्रि-आयामी वास्तुकला को बनाए रखते हैं, जिसमें अंतर के सभी चरणों में कोशिकाएं (यानी ऑस्टियोब्लास्ट, ऑस्टियोब्लास्ट, ऑस्टियोसाइट्स, स्ट्रोमेटल कोशिकाएं) शामिल हैं जो परिपक्व ऑस्टियोप्लास्ट और ऑस्टियोब्लास्ट, साथ ही खनिजमातृ14का नेतृत्व करते हैं। पूर्व वीवो मॉडल हड्डियों की बीमारियों की रोग प्रक्रिया का पूरी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं करता है। हालांकि, बोन रीमॉडलिंग या कैंसर से प्रेरित बोन ऑस्टियोलिसिस पर प्रभाव को सही तरीके से मापा जा सकता है।
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल में निम्नलिखित चरण होते हैं: 5-7 दिन पुराने चूहों, कैलवेरिया प्रीकल्चर, कैलवेरिया संस्कृति अनुप्रयोगों (उदाहरण के लिए, इंसुलिन, कैंसर कोशिकाओं या वातानुकूलित माध्यम की उपस्थिति में संस्कृति, और यहां तक कि एजेंटों से कैलवेरिया का विच्छेदन जांच के उद्देश्य के अनुसार चिकित्सीय क्षमता), हड्डी निर्धारण और कैल्वरिया डीक्काफिकेशन, ऊतक प्रसंस्करण, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, और परिणाम व्याख्या।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम हड्डी के गठन या अवशोषण का मूल्यांकन करने और कैल्वरियाल माउस की हड्डी के साथ कैंसर कोशिकाओं की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक कैल्वेरियाल पूर्व वीवो मॉडल के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने हिटोलॉजी के साथ उनकी मदद के लिए मारियो नोमुरा, एमडी और रोडोल्फो डियाज और पेपर की गुणवत्ता में सुधार के लिए अपनी बहुमूल्य टिप्पणियों के लिए पिरिक फोरनियर, पीएचडी का शुक्रिया अदा किया ।
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
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