Måle beinremodellering og gjenskape tumor-bone mikromiljøet ved hjelp av Calvaria co-kultur og histomorfometry

Summary

Ex vivo kulturen av bein planter kan være et verdifullt verktøy for studiet av bein fysiologi og den potensielle evalueringen av legemidler i bein remodeling og bein sykdommer. Den presenterte protokollen beskriver forberedelsen og kulturen til calvarias isolert fra nyfødte mus hodeskaller, samt dens applikasjoner.

Abstract

Bone er et bindevev som består av osteoblaster, osteocytter og osteoklaster og en mineralisert ekstracellulær matrise, noe som gir den sin styrke og fleksibilitet og gjør det mulig å oppfylle sine funksjoner. Bein er kontinuerlig utsatt for en rekke stimuli, som under patologiske forhold kan deregulere beinremodellering. For å studere beinbiologi og sykdommer og evaluere potensielle terapeutiske midler, har det vært nødvendig å utvikle in vitro- og in vivo-modeller.

Dette manuskriptet beskriver disseksjonsprosessen og kulturforholdene til calvariaer isolert fra nyfødte mus for å studere beindannelse og mikromiljøet av beinsvulsten. I motsetning til in vitro- og in vivo-modeller, tillater denne ex vivo-modellen bevaring av det tredimensjonale miljøet i vevet, samt det cellulære mangfoldet av beinet mens det er under definerte forhold for å simulere ønsket mikromiljø. Derfor er det mulig å undersøke beinremodeling og dets mekanismer, samt interaksjoner med andre celletyper, for eksempel interaksjoner mellom kreftceller og bein.

Analysene som er rapportert her, bruker calvarias fra 5-7 dager gamle BALB/C-mus. De hemi-calvarias oppnådd er kultivert i nærvær av insulin, brystkreftceller (MDA-MB-231), eller betinget medium fra brystkreft celle kulturer. Etter analyse ble det fastslått at insulin induserte ny beindannelse, mens kreftceller og deres betingede medium induserte beinresorpsjon. Den kaloribaserte modellen har blitt brukt i grunnleggende og anvendt forskning for å studere beinutvikling og kreftinduserte beinsykdommer. Samlet sett er det et utmerket alternativ for en enkel, informativ og rimelig analyse.

Introduction

Bone er et dynamisk bindevev som har flere funksjoner, inkludert å støtte musklene, beskytte indre organer og benmarg, og lagre og frigjøre kalsium- og vekstfaktorer^1,2. For å opprettholde sin integritet og riktig funksjon, er beinvev kontinuerlig under prosessen med ombygging. Generelt sett kan en syklus av beinremodeling deles inn i beinresorpsjon og bendannelse¹. En ubalanse mellom disse to fasene av beinremodeling kan føre til utvikling av beinpatologier. Også sykdommer som brystkreft påvirker ofte beinintegritet; omtrent 70 % av pasientene i avanserte stadier har eller vil ha beinmetastaser. Når brystkreftceller kommer inn i bein, påvirker de beinmetabolismen, noe som resulterer i overdreven resorpsjon (osteoklastiske lesjoner) og / eller dannelse (osteoblastiske lesjoner)³.

For å forstå biologien til beinsykdommer og utvikle nye behandlinger, er det nødvendig å forstå mekanismene som er involvert i beinremodellering. I kreftforskning er det viktig å undersøke beinmetastaseprosessen og dens forhold til det metastatiske mikromiljøet. I 1889, Stephen Paget hypotetisk at metastaser oppstår når det er kompatibilitet mellom tumorceller og målet vev, og foreslo at metastatisk området avhenger av affiniteten av svulsten for mikromiljøet⁴. I 1997 introduserte Mundy og Guise begrepet “ond syklus av beinmetastaser” for å forklare hvordan tumorceller endrer beinmikromiljøet for å oppnå overlevelse og vekst, og hvordan beinmikromiljøet fremmer veksten ved å gi kalsium- og vekstfaktorer^5,6,7.

For å karakterisere mekanismene som er involvert i beinremodellering og beinmetastase og for å evaluere molekyler med mulig terapeutisk potensial, har det vært nødvendig å utvikle in vitro og in vivo-modeller. Disse modellene presenterer imidlertid for tiden mange begrensninger, for eksempel forenklet representasjon av beinmikromiljøet, og deres kostnad^8,9. Kulturen av bein ex planter ex vivo har fordelen av å opprettholde den tredimensjonale organisasjonen samt mangfoldet av beinceller. I tillegg kan eksperimentelle forhold kontrolleres. Explant-modellene inkluderer kulturen av metatarsal bein, lårben, calvarias, og mandibulær eller trabecular kjerner¹⁰. Fordelene med ex vivo-modellene har blitt demonstrert i ulike studier. I 2009 rapporterte Nordstrand og samarbeidspartnere etableringen av en kokulturmodell basert på samspillet mellom ben- og prostatakreftceller¹¹. Også i 2012 rapporterte Curtin og samarbeidspartnere utviklingen av en tredimensjonal modell ved hjelp av ex vivo cocultures¹². Formålet med slike ex vivo-modeller er å gjenskape tilstandene i beinmikromiljøet så nøyaktig som mulig for å kunne karakterisere mekanismene som er involvert i normal eller patologisk beinremodellering og evaluere effekten av nye terapeutiske midler.

Den nåværende protokollen er basert på prosedyrene publisert av Garrett¹³ og Mohammad et al.¹⁴. Neonatal mus calvaria kulturer har blitt brukt som en eksperimentell modell, som de beholder tredimensjonal arkitektur av beinet under utvikling og bein celler, inkludert celler i alle stadier av differensiering (dvs. osteoblaster, osteoklaster, osteocytter, stromal celler) som fører til modne osteoklaster og osteoblaster, samt mineralisert matrise¹⁴. Ex vivo-modellen representerer ikke den patologiske prosessen med beinsykdommer helt. Effekter på beinremodellering eller kreftindusert beinosteokse kan imidlertid måles nøyaktig.

Kort sagt består denne protokollen av følgende trinn: disseksjon av calvarias fra 5-7 dagers gamle mus, calvaria preculture, calvaria kultur applikasjoner (f.eks kultur i nærvær av insulin, kreftceller eller betinget medium, og til og med midler med terapeutisk potensial, i henhold til målet med undersøkelsen), bein fiksering og calvaria avkalkning, vevbehandling, histologisk analyse, og resultattolkning.

Protocol

Alle mus som brukes i disse analyser ble hentet fra BALB / c mus stammer, ved hjelp av mannlige og kvinnelige mus ukritisk. Tidligere kultureksperimenter har også blitt utført ved hjelp av andre stammer, for eksempel FVB, sveitsiske mus, CD-1 og CsA mus11,,12,14. Alle mus ble plassert i henhold til National Institutes of Health (NIH) retningslinjer, Vedlegg Q. Prosedyrer som involverer dyreforsøk har blitt godkjent av Institu…

Representative Results

For å evaluere beindannelse i kalorimodellen dyrket vi hemi-calvarias i media med eller uten 50 μg/ml insulin. Vevsseksjoner ble tilberedt og farget med H&E. Under disse forholdene viste histologien at den strukturelle integriteten til calvarialbenet ble opprettholdt, slik at identifiseringen av de ulike komponentene (figur 1). Calvarias behandlet med insulin ga en økning i mengden beinvev sammenlignet med kontrollen (figur 2<…

Discussion

Her beskriver vi protokollen for en calvarial ex vivo-modell for å evaluere beindannelse eller resorpsjon og for å studere interaksjoner mellom kreftceller med calvarial musebein. De kritiske trinnene i denne teknikken er disseksjon, kultur, innebygging og histomorfometrisk analyse av calvarias. Under disseksjon av calvarias er det avgjørende å kutte hemi-calvarias i en trapes, da det sterkt vil lette orienteringen under parafininkluderingen. Når du studerer kreftcelleinteraksjoner med calvarias, er det vik…

Materials

24 well cell culture	Corning	CLS3524
24 well non tissue culture	Falcon	15705-060
2 mL cryovial	SSI	2341-S0S
Antibiotics-Antimycotic	Corning	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
Centrifugue	Eppendorf	22628188	Centrifuge 5810R
Coverslips	Corning	2935-24X50
Cytoseal resin	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate	Corning	10-017-CV
Dulbecco's PBS (10X)	Corning	20-031-CV
Ebedding Cassettes	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Golden	26400
Embedding Workstation	Thermo Scientific	A81000001
Eosin	Golden	60600
Ethanol absolute	JALMEK	E5325-17P
Fetal Bovine Serum	Biowest	BIO-S1650-500
Filters	Corning	CLS431229
Forceps and scissors	LANCETA HG	74165
Formalin buffered 10%	Sigma	HT501320
Glass slides 25 x 75 mm	Premiere	9105
Harris's Hematoxylin	Jalmek	SH025-13
High profile blades	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
Insulin from bovine pancreas	Sigma	16634
Microscope	ZEISS	Axio Scope.A1
Microtome	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
Mouse food, 18% prot, 2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
Orange G	Biobasic	OB0674-25G
Paraffin	Paraplast	39601006
Paraffin Section Flotation Bath	Electrothermal	MH8517X1
Petri dish	Corning	CLS430167
Phloxin B	Probiotek	166-02072
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin-EDTA	Corning	25-051-CI
Wax dispenser	Electrothermal	MH8523BX1
Xylene	Golden	534056-500ML