Single-overførselshastighed supplerende høj opløsning analytiske teknikker til kendetegner komplekse naturlig organisk materiale blandinger

Summary

Denne protokol beskriver et enkelt gennemløb for supplerende analytiske og omik teknikker kulminerede i en fuldt parret karakterisering af naturligt organisk materiale og mikrobielle proteomics i forskellige økosystemer. Denne fremgangsmåde tillader robust sammenligninger til identifikation af metaboliske reaktionsveje og transformationer vigtigt til at beskrive greenhouse gasproduktion og forudsige svar til miljøændringer.

Abstract

Naturlig organisk materiale (NOM) er sammensat af en meget kompleks blanding af tusindvis af organiske forbindelser, som historisk set har vist sig vanskeligt at karakterisere. Men for at forstå de termodynamisk og kinetisk kontrol greenhouse gas (kuldioxid [CO₂] og metan [CH₄]) produktionen som følge af nedbrydning af NOM, en molekylær-niveau karakterisering kombineret med mikrobielle proteom analyser er nødvendige. Yderligere, klima og miljømæssige ændringer forventes at forurolige naturlige økosystemer, potentielt forstyrre komplekse interaktioner, der påvirker både udbuddet af organisk materiale substrater og mikroorganismer, som udfører transformationerne. En detaljeret Molekylær karakterisering af det organiske stof, mikrobiel proteomics, veje og transformationer som organisk materiale nedbrydes vil være nødvendigt at forudsige den retning og omfanget af virkningerne af miljømæssige ændringer. I denne artikel beskrives en metodologisk overførselshastighed for omfattende metabolit karakterisering i en enkelt prøve ved direkte injektion Fourier transform-ion cyclotron resonance massespektrometri (FTICR-MS), gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, væskekromatografi massespektrometri (LC-MS) og proteomics analyser. Denne metode resulterer i en fuldt parret datasæt, som forbedrer statistiske tillid til udlede veje af organisk materiale nedbrydning, den resulterende CO₂ og CH₄ produktion priser og deres svar til miljømæssige undertrykkelse af netbårne. Heri præsenterer vi resultaterne af at anvende denne metode på NOM prøver indsamlet fra tørvemoser; protokollen er imidlertid gælder for enhver NOM prøve (fx, tørv, grønklædte jord, havsedimenter, osv.).

Introduction

Globalt, er vådområder anslået til at indeholde 529 Pg kulstof (C), for det meste som organisk C begravet i tørv indskud¹. I øjeblikket, fungere sådan tørvemoser som en netto C vask, binding 29 Tg C y^-1 i Nordamerika alene¹. Dog miljømæssige forstyrrelser såsom dræning, brande, tørke og varmere temperaturer kan udligne denne C vask ved at øge organisk materiale nedbrydning resulterer i øget C tab via drivhusgasser (kuldioxid [CO₂] og metan [CH₄]) produktion^1,2. Klimaændringer kan bidrage til C tab hvis varmere temperaturer eller tørretumbler betingelser stimulere hurtigere C nedbrydning af mikroorganismer. Alternativt, højere temperatur og luftens CO₂ kan stimulere primærproduktion til at udskille mere CO₂ som organisk kulstof (OC). I hvilket omfang og hvor hurtigt OC derefter nedbrydes til CO₂ og CH₄ afhænger af det komplekse samspil mellem elektron donor substrater, tilgængeligheden af elektronacceptorer og mikroorganismer, der formidler den transformation. I mange tilfælde mekanismerne er ikke godt karakteriseret, dermed deres reaktion på miljømæssige perturbationer er ikke godt begrænset og det er fortsat uklart, hvad Nettoresultatet af klimaændringer vil være på kulstofbalance i tørvemoser økosystemer.

Den komplekse karakter af naturligt organisk materiale (NOM) har lavet selv identificerer de organiske forbindelser i NOM blandinger historisk vanskelig. De seneste fremskridt har væsentligt forbedret vores evne til at karakterisere forbindelser der traditionelt og til dels fortsat betragtes som genstridige humusfraktionerne eller fulvic forbindelser^3,4,5. Vi forstår nu, at mange af disse forbindelser er faktisk microbially tilgængeligt og kan nedbrydes, hvis en passende terminal elektron acceptor (te) er gjort tilgængelige^6,7. Beregning af den nominelle oxidationstrin kulstof (NOSC) for et stof, der giver en metrikværdi til at forudsige risikoen for nedbrydning og energiudbytte af te kræves. Det kræver dog et molekylært niveau karakterisering af organisk materiale⁷. NOSC beregnes ud fra den molekylære formel via følgende ligning⁷: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, hvor z er den netto gebyr. NOSC er korreleret med den termodynamiske drivende kraft⁸, hvori forbindelser med højere NOSC er nemmere at forringe, mens forbindelser med lavere NOSC kræver mere og mere energiske te for at blive reduceret. Forbindelser med NOSC mindre end −2 kræver en høj energi giver te O₂, nitrat eller Mn^IV, og kan ikke blive forringet af almindeligt forekommende lavere energi giver te såsom Fe^III eller sulfat⁷. Dette er en vigtig overvejelse i de vandmættede anoxiske betingelser findes i vådområder hvor O₂ og andre høj energi giver teer er knappe⁹ og derfor nedbrydningen af lavere NOSC forbindelser under disse betingelser er termodynamisk begrænset. Miljømæssige undertrykkelse af netbårne kan påvirke den termodynamisk tilstand af økosystemet gennem hydrologiske ændringer, der påvirker O₂ (den mest energiske elektron acceptor), ændringer i økologisk substrater og elektronacceptorer stilles til rådighed af primære produktion, og i mindre grad af temperaturen. Et vigtigt eksempel på temperatureffekter i vådområde systemer sker med hensyn til den afvejning, der opstår mellem homoacetogenesis (dvs., acetat produktion fra CO₂ og H₂) og hydrogenotrophic () methanogenesis dvs., CH₄ produktion fra CO₂ og H₂). Ved lave temperaturer fremgår det, at homoacetogenesis er lidt begunstiget, mens varmere temperaturer favor CH₄ produktion¹⁰. Denne temperatur effekt kan have stor betydning for svaret af økosystemer til skiftende klima, som CH₄ er en meget kraftigere drivhusgas end CO₂¹¹ og dermed stigende produktion af CH₄ på bekostning af CO₂ på varmere temperaturer kan bidrage til en positiv feedback med klima opvarmning.

Tørvemoser producere globalt betydelige mængder af CO₂ og CH₄⁶via mikrobielle respiration af naturligt forekommende organiske noget. NOSC af organisk kulstof substrater bestemmer den relative andel af CO₂: CH₄ produceret, hvilket er en afgørende parameter på grund af den højere radiative tvinger CH₄ i forhold til CO₂¹¹, men også fordi modellering bestræbelser har identificeret dette forhold som en afgørende parameter for estimering C flux i tørvemoser¹². I mangel af terminal elektronacceptorer end CO₂, det kan påvises ved elektron balance at organisk C substrater med NOSC > 0 vil producere CO₂: CH₄ > 1, organisk C med NOSC = 0 producerer CO₂ og CH₄ i equimolar forhold, og økologiske C med NOSC < 1 vil producere CO₂: CH₄ < 1¹³. Nedbrydning af OC i naturlige økosystemer er medieret af mikroorganismer, således at selv når nedbrydning af et bestemt stof er termodynamisk muligt, det kinetically begrænses af aktivitet af mikrobielle enzymer og under iltfattige forhold, af den termodynamiske drivkraft (dvs.NOSC)⁷. Indtil nu har det udfordrende at fuldt ud for at beskrive det organiske stof, fordi mangfoldighed af forbindelser kræver forskellige supplerende teknikker til deres karakterisering. De seneste fremskridt har lukket hullet; ved hjælp af en suite af analytiske teknikker kan vi analysere en bred vifte af organiske forbindelser giver molekylært niveau karakterisering og i nogle tilfælde kvantificering, fra små primære metabolitter som glukose op til 800 Da poly-heterocycles. Tidligere ville sådanne store komplekse molekyler have været kendetegnet simpelthen så lignin-lignende eller tannin-lignende og antages at have været genstridige. Molekylær-niveau karakterisering, men tillader beregning af NOSC for selv disse store komplekse molekyler. Disse NOSC værdier er lineært korreleret med den termodynamiske drivende kraft giver mulighed for en vurdering af kvaliteten af organisk materiale til nedbrydning, som i mange tilfælde afslører, at disse komplekse molekyler kan faktisk være microbially nedbrydelige selv under de iltfattige forhold i vådområder.

Siden indførelsen af O₂ tillader organisk materiale af næsten alle naturligt observerede værdier for NOSC at være nedbrydes, fokuserer heri vi på ændringer i organisk materiale og mikrobielle proteomics, som er tilbøjelige til at være de primære drivere i vådområde (dvs., begrænset O₂) systemer. Men alle de teknikker, som vi vil diskutere kan anvendes til organisk materiale fra ethvert økosystem. Almindeligt, bulk målinger baseret på optiske og fluorescens analyser har været brugt til at vurdere organisk stof kvalitet^3,14. Når du bruger bulk målinger som disse, men går fine detaljer tabt som stort antal molekyler er kategoriseret sammen under generiske udtryk som humics eller fulvics. Definitioner af disse kategorier er ikke godt begrænsede og faktisk kan variere fra undersøgelse til undersøgelse gør sammenligninger umulige. Yderligere, bulk målinger ikke give den molekylære detaljer nødvendige for beregning af termodynamik for systemet og derfor ikke kommer op virkelig vurdere organisk stof kvalitet¹⁵.

Enkelte teknikker som Fourier transform ion cyclotron resonance massespektrometri (FTICR-MS), Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, gaskromatografi masse massespektrometri (GC-MS) og væskekromatografi massespektrometri (LC-MS) gør give sådanne Molekylær-detaljeringsgrad. Mens hver af disse teknikker præsenterer sine egne begrænsninger, sætter de også deres egne styrker, der kan udnyttes i en integreret tilgang til at opnå den fine molekylære detaljer nødvendige for kvantificering af organisk stof kvalitet i en streng termodynamisk forstand . GC-MS er nyttig til at identificere kritiske lille metabolitter, der er tilbøjelige til at have proksimale indflydelse på CO₂ og CH₄ produktion (fx, glukose, acetat, osv.); Men, GC-MS kræver kontrol mod en standard og er derfor begrænset til allerede kendte stoffer findes i databasen forhindrer identifikation af nye forbindelser. Desuden, GC-MS er en semi-kvalitative teknik giver inferens om ændringer i relative koncentrationer, men ikke med faktiske koncentration oplysninger nødvendige for beregning af Gibbs frie energi for eksempel. Endelig, GC-MS kræver forædling af molekyler inden analyse, som begrænser opløsning til forbindelser mindre end ~ 400 Da og flygtige alkoholer er tabt under trinnet til tørring.

Endimensional (1D) ¹H flydende tilstand NMR tillader meget kvantitative karakterisering af små metabolitter (herunder primær små molekylvægt metabolitter og flygtige stoffer som alkoholer, acetat, acetone, formate, pyruvat, succinat, kort-lænket fedtsyrer, samt en vifte af kulhydrater notorisk fraværende eller kompromitteret fra MS-baserede metoder) og deres koncentrationer er især nyttig til beregning af termodynamiske parametre. Endnu, som GC-MS, 1D NMR af komplekse blandinger kræver standardisering i forhold til en database og derfor alene tillader ikke nem identifikation af nye forbindelser, der sandsynligvis vil være rigelige i komplekse naturlige og skiftende økosystemer. Derudover NMR er mindre følsomme end de MS-baserede teknikker og derfor kvantitative metabolit profilering er opnået kun over 1 µM ved hjælp af NMR systemer udstyret med helium-cooled cold-sonder. Ikke meget værdsat, nogle NMR kolde-sonder er salt-tolerant og tillade miljømæssige blanding analyse i overværelse af millimolar salt koncentrationerne anvendes i mindre diameter (< 3 mm ydre diameter) prøve rør¹⁶. Men en yderligere komplikation af NMR er der store mængder af Paramagnetiske metaller og mineraler (f.eks., Fe og Mn over 1-3 wt %), som kan være rigelige i højlandet jorder, kan udvide spektrale beskrivere og komplicere fortolkningen af NMR-spektre . Ved hjælp af faste fase ekstraktion (SPE) kan aide i fortolkningen af både NMR- og MS-baseret metabolomics metoder ved at reducere de mineralske salte og øge spektrale kvalitet.

FTICR-MS ved direkte injektion er en yderst følsom teknik i stand til at opdage titusinder af metabolitter fra en enkelt prøve, men det ikke fange de kritiske lille metabolitter som acetat, pyruvat, succinat og er notorisk vanskeligt at brug for sukker og andre kulhydrater¹⁷, eller indeholder det kvantitative oplysninger. Men i modsætning til de andre teknikker, FTICR-MS udmærker sig ved at identificere og tildele roman forbindelser molekylformel og derfor identificerer det største antal forbindelser mere molekylære oplysning end nogen af de andre beskrevne teknikker. Dette er nyttigt, fordi de molekylære oplysningerne fra FTICR-MS (og andre teknikker) kan bruges til at beregne NOSC, som er relateret til den termodynamiske drivende kraft for sandsynligheden for visse reaktioner⁸ og deres priser under visse forhold⁷. Derudover ved at koble FTICR-MS med adskillelse teknikker, såsom LC sammen med tandem MS, kan kvantitative strukturelle oplysninger nås, modregning nogle af ulemperne ved denne teknik. LC-MS er nyttigt til identificering af lipid-lignende forbindelser og andre metabolitter, som ikke er godt præget af nogen af de andre metoder. Kobling LC FTICR-MS eller LC-MS med en brøkdel samler og indsamle brøkdele af specifikke ubekendte af interesse for strukturelle udredning af todimensionale (2D) flydende tilstand NMR er den ideelle situation for at identificere og kvantificere ukendte forbindelser^{18 ,19}. Dette er dog en meget tidskrævende skridt, der kunne bruges, hvis og når det er nødvendigt. Taget enkeltvis, hver af disse teknikker giver et anderledes øjebliksbillede af det organiske materiale, og ved at integrere dem, kan vi opnå en mere komplet forståelse end at bruge nogen af teknikkerne i isolation.

Mens de termodynamiske betragtninger de ultimative begrænsninger på hvad transformationer er muligt i et system, er organisk materiale nedbrydning medieret af mikroorganismer hvis enzym aktiviteter kontrollere reaktion priser. Således fuldt ud forstå kontrol på organisk materiale nedbrydning og i sidste ende greenhouse gas (CO₂ og CH₄) produktionen fra vådområder kræver en integreret omik tilgang til karakterisering af mikrobielle enzym aktiviteter samt metabolitter. I denne artikel vil beskrive vi en metode til at opnå en omfattende analyse fra en enkelt prøve ved hjælp af en sekventiel tilgang, der resulterer i en fuldt parrede analyse. Denne tilgang udvider på metabolit, proteiner og lipid udvinding (MPLex) protokol, hvor proteomics blev kombineret med GC-MS og LC-MS²⁰ at identificere små metabolitter, proteiner og lipider ved at indarbejde kvantitative metabolit oplysninger via NMR og identifikation af større sekundære metabolitter via FTICR-MS. lidt anderledes end MPLex, begynder vi protokol med en vand udvinding og derefter bruge sekventielle ekstraktion med i stigende grad ikke-polære opløsningsmidler. Alle ekstraktioner er udført på en enkelt prøve, som sparer prøve, når mængderne er begrænset eller vanskeligt at opnå og nedsætter eksperimentelle fejl indført gennem variation blandt delprøver fra heterogen prøve matricer (fx, jord og tørv) eller forskelle i opbevaringsforhold og varighed.

Endelig, ved at koble OM analyser med proteomics analyser af den mikrobielle samfund, kan vi bygge metaboliske netværk, der beskriver de veje og transformation af organisk materiale nedbrydning. Dette gør det muligt for os at teste specifikke hypoteser om hvordan perturbationer til systemet vil påvirke ultimative CO₂ og CH₄ produktion gennem ændring af de tilgængelige økologisk substrater, elektronacceptorer og de mikrobielle samfund mægle reaktioner via aktiviteten af enzymet katalysatorer.

Det overordnede mål med denne metode er at give et enkelt gennemløb protokol til at analysere metabolitterne, lipider og mikrobielle proteiner fra en enkelt prøve, hvorved der skabes et fuldt parrede datasæt for opbygning af metaboliske netværk mens begrænsende analytiske fejl .

Protocol

1. sekventiel udvinding af organisk stof fra jord, sedimenter eller tørv Indsamle jord, sedimenter eller tørv via coring og opdele kerner ifølge hypotesen bliver testet (f.eks., dybde). Butik prøver i Teflon belagt containere og fryse ved-80 ° C til opbevaring inden analyse.Bemærk: Ca 25 mg C er nødvendig for denne protokol. For tørv (typisk 45% C) er 50 mg tørret tørv påkrævet. Større mængder af prøven kan være behov for lavt organisk prøver som mineralsk eller skovklædt…

Representative Results

Vi udførte den beskrevne supplerende analyse protokol og sammenlignet tørv med dybde i S1 mosen i webstedet Gran og tørvemoser svar Under skiftende miljøer (Gran) i Minnesota, USA. Disse resultater er sammenlignet med dem fra en permafrost Mose og fen fra det nordlige Sverige at vise, hvordan websteder kan variere i metabolit og enzym aktiviteter. Vi identificerede 3,312 enzymer i proteomics analyser. En analyse af enzymer aktiviteter med dybde afslører, at antallet af enzymer afviser skarpt mellem 15 cm og 45 cm i …

Discussion

Single-overførselshastighed, fuldt kombineret analyse stream bruges til at karakterisere metabolitter og proteomet giver indsigt i de veje, af hvilken C cykling foregår i et komplekst økosystem. Jord og tørv er heterogene matricer, og en af de afgørende trin i denne metode opstår derfor i de tidligste trin for at sikre, at start tørv eller jord materiale er meget homogene. Det er at foretrække at male prøven samt aggregater kan reducere ekstraktionseffektivitet. Dette er et særligt problem for aggregerede jord …

Materials

methoxyamine hydrochloride	Sigma Aldrich	226904	derivitization agent
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe	Bruker		instrumentation
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)	Agilent	AG19091S-433	instrumentation
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size)	ThermoFisher		instrumentation
2 mL glass vials	VWR International	46610-722	sample vials
autosampler vials	VWR International	97055-324; 9467671	sample vials
Chloroform	VWR International	JT9174-3	solvent
Ethanol	VWR International	BDH67002.400	solvent
methanol	VWR International	BDH85681.400	solvent
pyridine	VWR International	BDH67007.400	solvent
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6	Sigma Aldrich	178837	standard
C8-C24 fatty acid methyl ester	Sigma Aldrich	CRM18918	standard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide	Sigma Aldrich	24589-78-4	standard
Suwanee River Fulvic Acid standard	International Humic Substances Society	2S101F	standard
trimethylchlorosilane	Sigma Aldrich	89595	standard
Tuning Solution	Agilent
FTICR-MS analysis software	Bruker	Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software	Pacific Northwest National Laboratory	Formularity	available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS	Agilent	Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent	Phenomenex (Torrance, CA)	Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5	VWR International	KT897820-0008	NMR tube
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer	Varian Inova	Varian Direct Drive 600-MHz	NMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3	Chenomx	Chenomx NMR Suite	NMR software
ultra-performance liquid chromatograph	waters	Aquity UPLC H	liquid chromatograph
Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer	ThermoFisher	Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos	mass spectrometer