シングル スループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法
Summary
このプロトコルでは、相補的な分析とオミックス技術の天然有機物と異なる生態系における微生物のプロテオミクスの完全にペアの特性で最高潮に達する単一のスループットについて説明します。この方法は、代謝と環境変化への応答を予測する温室効果ガス生産を記述するため重要な変換を識別するための堅牢な比較を許可します。
Abstract
天然有機物 (NOM) は、歴史的に、特徴付けることは困難証明する有機化合物の何千もの非常に複雑な混合物で構成されます。ただし、公称値の分解から生じる温室効果ガス (二酸化炭素 [CO2] と [4CH] メタン) 生産の熱力学的および速度論的コントロールを理解する分子レベルの特性と相まって微生物プロテオーム解析が必要です。さらに、気候や環境の変化は、有機物の基質の供給と、変換を実行する微生物に影響を与える複雑な相互作用を動揺させる可能性のある自然の生態系を混乱させると予想されます。有機物、微生物のプロテオミクスと経路および有機物の分解、変換の詳細な分子特性解析は、方向と環境変化の影響の大きさを予測する必要があります。直接注入するフーリエ変換イオン サイクロトロン共鳴質量分析法 (FTICR MS)、ガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC/MS)、単一サンプルの包括的な代謝産物解析の方法論的スループットについて説明します核磁気共鳴 (NMR) 分光法、液体クロマトグラフィーの質量分析計 (LCMS)、およびプロテオミクス解析。このアプローチは、有機物の分解、結果 CO2 CH4生産率、環境変動への応答の経路を推定の統計的信頼度を向上させる完全にペアのデータセットの結果します。ここを提案する; の泥炭地帯から収集されたサンプルの公称値にこの手法を適用した結果ただし、プロトコルは、任意の公称サンプル(例えば泥炭、森林土壌、海洋堆積物等)に適用されます。
Introduction
世界的に、湿地は、泥炭の沈殿物の1で埋められる有機 C 主として炭素 (C) の 529 の Pg が含まれてと推定されます。現在、このような泥炭地は、北アメリカ単独で1に 29 の Tg C y-1を隔離ネット C シンクとして機能します。しかし、流出、火災、干ばつ、気温などの環境外乱は、温室効果ガスの増加 C 損失を介して有機物分解を増やすことによってこの C シンクを相殺できる (二酸化炭素 [CO2] とメタン [4CH]) 生産1,2。気候変動より暖かい温度や乾燥条件微生物による高速 C 分解を刺激する場合 C の損失に貢献するかもしれない。また、高い温度と大気 CO2濃度の有機炭素 (OC) としてより多くの CO2を隔離する第一次生産を刺激するかもしれない。その OC は CO2に分解されます、どの程度、どのくらいの速と CH4電子ドナー基板、電子アクセプターの可用性および媒介微生物間の複雑な相互作用に依存、変換です。多くの場合、メカニズムよ特徴付けられた、従って環境変動への応答はよく制限されませんは、泥炭地生態系における炭素収支に気候変動の結果がされるかは不明のまま。
天然有機物 (NOM) の複雑な性質も歴史的に困難な公称値の混合物である有機化合物を識別しました。最近の進歩は、伝統的にその化合物を特徴づけるし、ある程度手に負えない腐植またはフルボ化合物3,4、5とみなされる、継続する当社の能力を大幅改善しています。我々 は今、これらの化合物の多くが実際に微生物があり、適切なターミナル電子アクセプター (茶) が利用可能な6,7を行われた場合に分解する可能性がありますを理解します。化合物の炭素 (NOSC) の名目の酸化状態を計算する分解と必要なお茶のエネルギー収率の可能性を予測する指標を提供します。ただし、7有機物の分子レベルの特性評価が必要です。NOSC が、分子式を介して次の方程式7から計算されます: NOSC − = ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S))/(#C)) + 4、z は純充満。NOSC は、熱力学的駆動力8、前記化合物より高い NOSC が低下、低い NOSC 化合物が減少するためにますますエネルギッシュな茶を必要としながら容易に相関しています。NOSC − 2 未満化合物 O2、硝酸マンガンIVなど紅茶を産する高エネルギーを必要とし、一般的に発生することはできませんが低下する鉄IIIなどのお茶をもたらすエネルギーを低くか、7の硫酸塩します。これは水浸しの無酸素状態の湿地帯、O2と茶を産する他の高エネルギーが乏しい9したがってこれらの条件の下で低い NOSC 化合物の分解に重要な考慮事項熱力学的に制限されています。O2 (最もエネルギッシュなの電子アクセプター)、有機基板と可能な電子アクセプターの変化に影響を及ぼす地下水の変化を通じて生態系の熱力学的状態に影響を与える環境の摂動によってプライマリ生産、温度によってより小さい範囲に。Homoacetogenesis (すなわちCO2 H2酢酸生産) と hydrogenotrophic によるメタン生成 (の間に発生するトレードオフに関して発生する湿地における温度の影響の重要な例すなわちCO2 H2CH4生産)。低温では、その homoacetogenesis は、支持は少し暖かい温度を好む CH4生産10が表示されます。この温度の影響は、CH4は CO211とこの犠牲に CH4の生産の増加よりもはるかに強力な温室効果ガス、気候変動に生態系の応答の重要な意味があります。暖かい温度で CO2の気候温暖化の肯定的なフィードバックに貢献するかもしれない。
泥炭地は、CO2のグローバル重要な量を作り出すし、有機天然の微生物呼吸を介してCH4の6の問題します。有機炭素基板 NOSC が CO2の相対的な割合を決定します: CH4生産に比べて CO211、しかしまたので CH4の高い放射強制のための重大な変数であります。モデリング作業は、泥炭地12C フラックスの推定の重要なパラメーターとして、この比率を識別しました。CO2以外のターミナル電子アクセプターの不在、それ示すことができる電子バランスで NOSC > 0 にする有機 C 基板が CO2を生成: CH4 > 1、NOSC 有機 C = 0 生成する CO2 CH 4モル比と NOSC 有機 C < 1 が生成されます CO2: チャンネル4 < 113。自然の生態系で OC の分解微生物が媒介、特定の化合物の分解を熱力学的に可能な場合でも速度論的に制限し、無酸素条件下で微生物酵素の活動で、熱力学の原動力 (すなわちNOSC)7。今までは、化合物の存在の多様性のさまざまな補完的な技術を必要とするため、有機物を完全に特徴づけるチャレンジしております。最近の進歩はギャップを閉じています。分析技術のスイートを使用して有機化合物の分子レベルの特性を提供するのと、800 Da ポリ複素環までブドウ糖のような小さな主代謝物から、いくつかのケース定量化の大規模な範囲を分析できます。以前このような大規模な複雑な分子が特徴づけられている単にリグニンやタンニン様と反抗的なされていると仮定します。分子レベルの特性評価、ただし、NOSC のもこれらの大きな複雑な分子のための計算ができます。これら NOSC 値は有機物の分解は、多くの場合これらの複雑な分子が微生物が実際に明らかに使用可能な品質の評価を可能にする熱力学の原動力に線形相関します。湿地で勝つ無酸素条件下でも分解します。
O2の導入により、有機物分解するほぼすべての自然観測 NOSC 値のです、のでここに着目し有機物と微生物のプロテオミクス (はすなわち、湿地における主な要因をする可能性がある変更限られた O2) システム。しかし、について説明しますすべての技術は、あらゆる生態系から有機物に適用できます。一般的に、一括測定に基づいて光と蛍光分析は、有機物質3,14を評価するために使用されています。一括測定など、これらを使用している場合ただし、細部が失われる分子の数が多いを一緒に humics や fulvics のような一般的な条件の下で分類される、これらのカテゴリの定義よく拘束されていないと、実際には、研究から作る比較不可能を異なる場合があります。さらに、一括測定システムを支配する熱力学の計算に必要な分子の詳細を提供していない従って偽りなく有機物質15の評価を下回る。
フーリエなど個々 の技術を変換イオン サイクロトロン共鳴質量分析 (FTICR MS)、核磁気共鳴 (NMR) 分光法、ガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC/MS)、液体クロマトグラフィーの質量分析計 (LCMS)このような分子レベルの詳細を提供します。これらの方法で独自の制限は、彼らはまた厳格な熱力学的意味での有機物質を定量化するために必要な分子細部を達成するために統合されたアプローチに活用ことができる自分の強みをもたらす.GC-MS は CO2 CH4の生産(例えばグルコース、酢酸等);近位影響を与える可能性のある重要な小さな代謝物を識別するのに役立ちますただし、GC-MS 標準に対する検証を必要とは、既に知られている化合物の新規化合物の同定を防止するデータベース内に存在する限られました。さらに、GC MS は相対濃度変更についての推論を許可するが、たとえばギブズ自由エネルギーを計算するために必要な実際の集中情報を提供していない半定性的手法です。最後に、GC-MS 分析化合物 〜 400 Da よりも小さい解像度を制限する前に分子の誘導体化を必要として揮発性のアルコールは乾燥中に失われます。
一次元 (1 D) 1H 液体状態の NMR により小さな代謝物 (分子量が小さい主代謝物、アルコール、酢酸、アセトン、ギ酸、ピルビン酸、コハク酸のような揮発性物質を含む高度定量化悪名高い欠席または MS ベースのメソッドから侵害された炭水化物の範囲と同様、短いチェーン脂肪酸)、その濃度が熱力学的パラメーターを計算する場合に特に便利です。まだ、GC-MS のような複雑な混合物の 1 次元 NMR データベースに対する標準化が必要です、自然と変化の複雑な生態系で豊富なことを可能性のある新規化合物を容易に識別を単独で許可しませんしたがって。さらに、NMR、MS ベースの手法よりも重要度の低い、したがって、定量的代謝物プロファイリング ヘリウム冷却コールド プローブを搭載した NMR を用いた 1 μ M 以上のみが実現します。ない広く高く評価されて、いくつかの NMR のコールド プローブ耐塩性、小さい直径 (< 3 mm 外径) サンプル チューブ16で使用する場合、millimolar の塩濃度の存在下で混合物の環境分析を許可します。しかし、NMR のそれ以上の合併症は、常磁性金属や鉱物を多量 (例えばFe と Mn 畑土壌における豊富なすることができます、1-3 wt %)上記できますスペクトル特徴を広げるし、NMR スペクトルの解釈を複雑にします。.固相抽出 (SPE) を用いた NMR および MS ベース メタボロミクスの解釈で補佐官をすることができますミネラル塩を減らすとスペクトルの品質が向上します。
直噴で FTICR MS は単一サンプル由来の代謝産物の数万人を検出できる高感度技術それは酢酸、ピルビン酸、コハク酸など重要な小さな代謝産物をキャプチャしません、困難ですが砂糖や他の炭水化物の17、用も定量的な情報を提供します。ただし、他の技術とは異なり、FTICR MS を識別して新規化合物の分子式を割り当てるに優れています、したがって化合物、その他の記載された方法のいずれかよりもより分子の情報を提供するの最大数を指定します。8特定の反応とその率下での尤度を支配する熱力学の原動力に関連している NOSC を計算する FTICR MS (および他の技術) によって提供される分子情報を使用できるので、これは便利条件7。さらに、タンデム MS と LC の分離技術と FTICR MS を結合することによって構造の定量的な情報が達成でき、この手法の欠点のいくつかを相殺します。LC-MS は脂質のような化合物と他の方法のいずれかによって特徴は他の代謝物を識別するのに役立ちます。一部コレクターと二次元 (2 D) 液体状態 NMR は識別し、未知の化合物18 を定量化のための理想的な状況による構造解明のための興味の特定の未知数の分数を収集 LC-MS FTICR または LC-MS を結合 ,19。しかし、これは必要な場合に使用することができる非常に時間がかかるステップです。個別に撮影、各技術は有機物の別のスナップショットを提供し、統合することで、単独での任意の方法を使用するよりもより完全な理解を実現します。
に関する熱力学的考察を設定、システムで可能な変換に究極の制約、有機物の分解は微生物が酵素反応速度の制御によって媒介されます。したがって、微生物酵素活動にオミクス統合アプローチが必要です完全に有機物の分解と最終的に湿地からの温室効果ガス (CO2 CH4) 生産のコントロールを理解と同様代謝物。この記事では結果を完全にペアの解析でシーケンシャル方式を使用して 1 つのサンプルからこのような包括的な分析を達成するための方法をについて説明します。このアプローチを拡張代謝・蛋白質・脂質の抽出 (MPLex) のプロトコル プロテオミクスだった GC MS と LC MS20定量的代謝物の情報を組み込むことにより小型の代謝、蛋白質および脂質を識別するために結合しています。経由でNMR および大きい二次代謝産物を介してFTICR さん少し MPLex に別の識別、我々 は水抽出し、ますます非極性溶剤使用連続抽出プロトコルを開始します。すべて抽出がボリュームが限られているまたは入手が困難なときはサンプルを節約し異種試料 (例えば、土および泥炭) から因数変異を介しての実験誤差を減少させる 1 つのサンプルで行われるか保管条件と期間の違い。
最後に、微生物群集のプロテオミクス解析と OM の分析を結合することにより経路と有機物分解の変換を記述する代謝ネットワークを構築できます。これにより、私たちは究極の CO2 CH4生産し使用可能な有機基板、電子受容体、微生物群集の変化を通じてのシステムに対する摂動論の影響についての特定の仮説をテストするには反応を介して酵素触媒の活動を仲介します。
このメソッドの全体的な目標はそれにより解析エラーを制限しながら代謝ネットワークを構築するため完全にペア データセットの作成 1 つのサンプルから微生物の蛋白質、脂質、代謝物を分析するため単一スループット プロトコルを提供するために、します。.
Protocol
Representative Results
Discussion
シングル スループット代謝産物とプロテオームを特徴付けるために使用完全連成解析ストリームは、複雑な生態系の循環が発生して C によって経路への洞察を提供します。異種の行列は、泥炭土、したがって、このメソッドの重要な手順の 1 つは開始泥炭または土材料は均質な高度を確保する上で最初のステップで行われます。集計は、抽出効率を減らすことができますだけでなく、サンプ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
泥炭のサンプルを収集することが支援のため j. p. Chanton、J.E. コストカと MM のコルトンに感謝したいと思います。この作品の一部は、DOE のオフィスの科学ユーザー施設オフィスの生物と環境研究主催の環境分子科学研究所行った。バテル契約 DE AC05 76RL01830 下 DOE のなりが運営しています。この作品は、米国エネルギー省科学局、オフィスの生物学・環境研究によって支えられた (付与: デ SC0014416、・ デ ・ SC0012088、DESC0010580 ・ デ ・ SC0004632 ・ デ ・ AC05 00OR22725)。
Materials
| methoxyamine hydrochloride | Sigma Aldrich | 226904 | derivitization agent |
| 5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe | Bruker | instrumentation | |
| capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) | Agilent | AG19091S-433 | instrumentation |
| reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) | ThermoFisher | instrumentation | |
| 2 mL glass vials | VWR International | 46610-722 | sample vials |
| autosampler vials | VWR International | 97055-324; 9467671 | sample vials |
| Chloroform | VWR International | JT9174-3 | solvent |
| Ethanol | VWR International | BDH67002.400 | solvent |
| methanol | VWR International | BDH85681.400 | solvent |
| pyridine | VWR International | BDH67007.400 | solvent |
| 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 | Sigma Aldrich | 178837 | standard |
| C8-C24 fatty acid methyl ester | Sigma Aldrich | CRM18918 | standard |
| N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | standard |
| Suwanee River Fulvic Acid standard | International Humic Substances Society | 2S101F | standard |
| trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 89595 | standard |
| Tuning Solution | Agilent | ||
| FTICR-MS analysis software | Bruker | Compass DataAnalysis 4.1 | |
| Formularity Software | Pacific Northwest National Laboratory | Formularity | available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity |
| GC-MS | Agilent | Agilent GC 7890A with MSD 5975C | |
| silica-based sorbent | Phenomenex (Torrance, CA) | Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK) | |
| NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 | VWR International | KT897820-0008 | NMR tube |
| Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer | Varian Inova | Varian Direct Drive 600-MHz | NMR spectrometer |
| Chenomx NMR Suite 8.3 | Chenomx | Chenomx NMR Suite | NMR software |
| ultra-performance liquid chromatograph | waters | Aquity UPLC H | liquid chromatograph |
| Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer | ThermoFisher | Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos | mass spectrometer |
References
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