Identifikasjon av romanen CK2 Kinase underlag med en allsidig biokjemiske tilnærming
Summary
Målet med denne protokollen er etiketten, berike og identifisere underlag av protein kinase CK2 fra et komplekse biologiske utvalg som en celle lysate eller vev homogenate. Denne metoden bruker unike aspekter av CK2 biologi for dette formålet.
Abstract
Studiet av kinase-underlaget relasjoner er viktig å få en fullstendig forståelse av funksjonene til disse enzymer og deres nedstrøms mål i både fysiologiske og patologiske tilstander. CK2 er et evolusjonært bevarte serine/threonin kinase med en voksende liste av hundrevis av underlag involvert i flere cellulære prosesser. På grunn av pleiotropic egenskaper, identifisere og karakterisere et omfattende sett av CK2 underlag er spesielt utfordrende og forblir et hinder i studiet av dette viktige enzymet. For å møte denne utfordringen, har vi utviklet en allsidig eksperimentelle strategi som aktiverer målrettet berikelse og identifikasjon av antatte CK2 underlag. Denne protokollen utnytter unike doble co substrat spesifisiteten av CK2 tillater for bestemte thiophosphorylation av sin underlag i en celle eller vev lysate. Disse substrat proteiner er senere alkylated, immunoprecipitated, og identifiseres av flytende kromatografi/tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Vi har brukt denne tilnærmingen å kunne identifisere CK2 underlag fra Drosophila eggstokkene og her vi utvide bruken av denne protokollen til menneskelig glioblastom celler, illustrerer tilpasningsevne denne metoden til å undersøke den biologiske rollene til denne kinase i ulike modell organismer og eksperimentelle systemer.
Introduction
Protein kinaser er sentrale komponenter av signal signaltransduksjon cascades. Fosforylering substrat proteiner av disse enzymene utløser biologiske respons som regulerer kritiske hendelser kontrollere celledeling, metabolisme og differensiering, blant andre. CK2 er en overalt uttrykte, syre serine/threonin kinase som er bevart fra gjær til mennesker og som spiller viktige roller i mange mobilnettet prosesser, fra transcriptional regulering til celle syklus progresjon til apoptose1 ,2,3. Enzymet er en heterotetramer består av to katalytisk î± (eller α’) underenheter og to regulatoriske β underenheter4. Er svært pleiotropic, har CK2 to andre uvanlige egenskaper som kompliserer sin analyse, nemlig grunnleggende aktivitet5 og dobbelt co substrat spesifisitet6. Sistnevnte egenskapen endows CK2 muligheten til å bruke GTP samt ATP for fosforylering substrat proteiner.
Genetisk sletting av de katalytiske eller forskriftsmessige underenheter av CK2 i mus gir embryonale dødelighet som indikerer at den spiller avgjørende roller under utvikling og organogenesen7,8. CK2 er også overexpressed i flere typer kreft og dermed representerer en lovende terapeutisk mål9,10,11. Faktisk, bestemte hemmere som CK2 kinase målaktiviteten er under etterforskning for dette formålet12,13,14. Mens hemming av CK2 er et levedyktig alternativ, gitt sin pleiotropic natur, et alternativ, og kanskje mer rasjonell tilnærming ville være å målrette kritiske CK2 underlag underlie progresjon av visse kreftformer. Derfor ville omfattende identifikasjon og karakterisering av CK2 substrat proteiner være betydelig fordel for Klargjørende den spesifikke funksjon av denne kinase innenfor en bestemt vev eller svulst type.
Her beskriver vi en allsidig biokjemiske metode for å identifisere CK2 underlag fra et komplekse biologiske utvalg som en celle eller vev lysate. Denne protokollen utnytter dual co substrat spesifisiteten av CK2 ved bruk av den GTP analogt GTPγS (guanosine 5′-[γ-thio]triphosphate) som andre endogene kinaser ikke kan bruke. Effektivt kan kinase til “etiketten” sin underlag i dette eksemplet for påfølgende isolasjon og identifikasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en relativt enkel biokjemiske metode for å identifisere underlag av protein kinase CK2 fra et komplekse biologiske utvalg. De avgjørende skritt i denne protokollen er basert på uvanlig enzymatisk egenskapene for CK2 og inkluderer CK2-avhengige thiophosphorylation bestemt substrat proteiner med GTPγS og påfølgende immunoprecipitation og identifikasjon. Med disse resultatene har vi vist av og allsidighet av denne tilnærmingen som vi nå har søkt denne strategien i både menneskelige gliobl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet var støttes delvis av en Commonwealth Universal forskning ekstrautstyr bevilgning fra Pennsylvania Department of Health å T.I.S.
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
