Radioinmunoterapia pretargeted basada en la reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa
Summary
Este protocolo describe la síntesis y caracterización de un transporte– cyclooctene (TCO)-modifica un radioligando de Lu-labeled tetrazina (Tz) 177para radioinmunoterapia pretargeted (PRIT) y el anticuerpo. Además, detalla el uso de estas dos construcciones en vivo biodistribución y estudios longitudinales de la terapia en un modelo murino de cáncer colorrectal.
Abstract
La radioinmunoterapia (RIT) es un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer, la vida media larga farmacocinética de anticuerpos radiactivos puede resultar en altas dosis de radiación a los tejidos sanos. Tal vez no es de extrañar varias estrategias diferentes se han desarrollado para eludir esta limitación preocupante. Uno de los más prometedores de estos enfoques es pretargeted radioinmunoterapia (PRIT). PRIT se basa en disociar el radionúclido de la inmunoglobulina, inyectarlas por separado y luego lo que les permite combinar en vivo en el tejido diana. Este enfoque aprovecha las propiedades excepcionales de tumor targeting de anticuerpos mientras que bordea sus inconvenientes farmacocinéticos, bajar las dosis de radiación a los tejidos no Diana y facilitar el uso de radionúclidos con vidas medias que son considerado demasiado corto para uso en radioimmunoconjugates tradicional. En los últimos cinco años, nuestro laboratorio y otros han desarrollado un enfoque en vivo pretargeting basa en la reacción de Diels-Alder (IEDDA) de demanda electrónica inversa entre transporte– cyclooctene (TCO) y tetrazina (Tz). Esta estrategia se ha aplicado con éxito a pretargeted tomografía por emisión de positrones (PET) y computarizada por emisión de fotón único tomografía (SPECT) proyección de imagen con una variedad de sistemas antígeno-anticuerpo. En un par de publicaciones recientes, hemos demostrado la eficacia de PRIT IEDDA basado en modelos murinos de adenocarcinoma ductal de páncreas y carcinoma colorrectal. En este protocolo, describimos protocolos por PRIT usando un radioligando de 177Lu-DOTA-labeled tetrazina (Lu-DOTA-PEG [177Lu]7– Tz) y una variante modificada de TCO del cáncer colorrectal a anticuerpo huA33 (huA33-TCO). Más concretamente, vamos a describir la construcción de huA33-TCO, la síntesis y de Lu-DOTA-PEG radiolabeling de [177Lu]7– Tz y el rendimiento de biodistribución en vivo y estudios longitudinales terapia en modelos murinos de carcinoma colorrectal.
Introduction
La radioinmunoterapia (RIT), el uso de anticuerpos para la entrega de los radionucleidos terapéuticos para tumores — ha sido un enfoque atractivo para el tratamiento de cáncer1,2. De hecho, esta promesa ha sido puesto de relieve por la aprobación de los Estados Unidos administración de alimentos y drogas de dos radioimmunoconjugates para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin: 90Y-ibritumomab tiuxetan y 131-tositumomab3 , 4. sin embargo, incluso desde sus primeros días, las perspectivas clínicas de RIT han visto obstaculizadas por una complicación crítica: las tasas de dosis alta de radiación a tejidos sanos5,6. En general, radioimmunoconjugates de RIT están marcados con radionucleidos de larga vida (p. ej., 131I [t½ = 8,0 días] y 90Y [t½ = 2,7 días]) con vida media física que encajar bien con la largo farmacocinética vida media de las inmunoglobulinas. Esto es esencial, como asegura que eso suficiente radiactividad sigue siendo una vez que el anticuerpo ha alcanzado su biodistribución óptimos después de varios días de circulación. Sin embargo, esta combinación de tiempos de residencia largos en la sangre y vida media larga física resulta inevitablemente en la irradiación de los tejidos sanos, lo que reducir la relación terapéutica y limitar la eficacia de la terapia7. Se han explorado diversas estrategias para evitar este problema, incluyendo el uso de fragmentos de anticuerpos truncado como Fab, Fab’, F(ab’)2, minibodies y nanobodies8,9,10. Una de las más prometedoras y fascinante, pero indudablemente complejos enfoques alternativos es en vivo pretargeting11.
En vivo pretargeting es una aproximación a la proyección de imagen nuclear y la terapia que busca aprovechar la exquisita afinidad y selectividad de anticuerpos mientras bordeando sus inconvenientes farmacocinéticos11,12,13. Para ello, los anticuerpos radiactivos utilizados en la radioinmunoterapia tradicional es deconstruido en dos componentes: un radioligando de molécula pequeña y un immunoconjugate que puede enlazar tanto un antígeno de tumor y el ya mencionado así. El immunoconjugate se inyecta primero y da una ventaja, a menudo varios días, durante el cual se acumula en el tejido diana y elimina de la sangre. Posteriormente, se administra el radioligando de molécula pequeña y combina con el immunoconjugate en el tumor o elimina rápidamente del cuerpo. En esencia, en vivo pretargeting se basa en realizar radiochemistry dentro del propio cuerpo. Al reducir la circulación de la radiactividad, este enfoque reduce la dosis de radiación a los tejidos sanos y simultáneamente facilita el uso de radionucleidos (p. ej., 68Ga, t½ = min 68211; Como t½ = 7,2 h) con vida media que normalmente se considera incompatible con vectores basados en anticuerpos.
A partir de la década de 1980, un puñado de diferentes enfoques en vivo pretargeting han sido desarrollados, incluyendo estrategias basadas en la interacción estreptavidina-biotina, tienen anticuerpos y la hibridación de complementarios oligonucleótidos14,15,16,17,18. Pero cada uno se ha celebrado nuevamente en diversos grados por complicaciones, más famosa la inmunogenicidad potente de anticuerpos modificados de estreptavidina19,20. En los últimos cinco años, nuestro grupo y otros han desarrollado un enfoque en vivo pretargeting basa en la ligadura rápido y bioorthogonal inversa electrónica demanda Diels-Alder entre transporte– cyclooctene (TCO) y tetrazina (Tz) 2122,de,23,24. La más exitosa de estas estrategias ha utilizado un anticuerpo modificado de TCO y un radioligando Tz-cojinete, como TCO es normalmente más estable en vivo que su Tz socio (figura 1)25,26. Como en otras metodologías pretargeting, el immunoconjugate mAb-TCO es administrado en primer lugar y dado el tiempo para borrar de la circulación y se acumulan en el tejido del tumor. Posteriormente, se inyecta el radioligando Tz de molécula pequeña, después de lo cual hace clic con el immunoconjugate dentro del tejido de destino o elimina rápidamente del cuerpo. Esta en vivo pretargeting estrategia ha demostrado ser altamente eficaz para PET y SPECT proyección de imagen con varios sistemas diferentes anticuerpos/antígeno, constantemente produciendo imágenes con alto contraste y que permite el uso de radionuclides de breve duración tales como 18 F (t½ = 109 min) y 64(t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Más recientemente, la eficacia de la base haga clic en la radioinmunoterapia pretargeted (PRIT) ha demostrado en modelos murinos de la adenocarcinoma ductal pancreática (PDAC) y carcinoma colorrectal27,28. Para ello, la terapéutica con radionúclidos 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 días) fue empleado junto con dos anticuerpos diferentes: 5B1, que apunta a antígeno carbohidrato 19.9 (CA19.9) ubicuo expresado en PDAC , y huA33, que dirige el A33, una glicoproteína transmembrana expresa en > 95% de los cánceres colorrectales. En ambos casos, este enfoque 177Lu-PRIT produjo concentraciones de alta actividad en tejido tumoral creó un efecto terapéutico dependiente de la dosis y al mismo tiempo reduce las concentraciones de actividad en los tejidos sanos en comparación con el tradicional directamente-con la etiqueta radioimmunoconjugates.
En este artículo, describimos protocolos por PRIT usando un radioligando de 177Lu-DOTA-labeled tetrazina (Lu-DOTA-PEG [177Lu]7– Tz) y una variante modificada de TCO del anticuerpo huA33 (huA33-TCO). Más específicamente, se describe la construcción de huA33-TCO (figura 2), la síntesis y de Lu-DOTA-PEG radiolabeling de [177Lu]7– Tz (figura 3 y figura 4) y el rendimiento de en vivo biodistribución y estudios longitudinales terapia en modelos murinos de carcinoma colorrectal. Además, en los resultados representativos y discusión, presentamos un conjunto de datos de muestra, posibles estrategias de dirección para la optimización de este enfoque y considerar esta estrategia en el contexto más amplio de en vivo pretargeting y PRIT. Por último, es importante tener en cuenta que si bien hemos optado por centrarse en pretargeting con huA33-TCO y [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz en este protocolo, esta estrategia es altamente modular y se puede adaptar a una amplia gama de anticuerpos y radionúclidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno de los puntos fuertes de este enfoque en vivo pretargeting — especialmente en lo referente a estrategias basadas en anticuerpos tienen y radiactiva haptenos, es su modularidad: transporte– cyclooctene fracciones pueden ser añadidos a cualquier anticuerpo, y tetrazina radioligands puede ser radiactiva con una extraordinaria variedad de radionucleidos sin deteriorar su capacidad de reaccionar con sus socios de clic. Sin embargo la adaptación de este enfoque a otros sistema de antígeno anticuerpo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Dr. Jacob Houghton para conversaciones útiles. Los autores quisieran agradecer a los NIH para su financiación generosa (R00CA178205 y U01CA221046).
Materials
| (E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) | Sigma-Aldrich | 764523 | Store at -80 °C |
| 2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) | Sigma-Aldrich | 764701 | Store at -80 °C |
| Acetonitrile (MeCN) | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Ammonium Acetate (NH4OAc) | Fisher Scientific | A639-500 | |
| Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 70023 | Store at -20 °C |
| Dichloromethane (DCM) | Fisher Scientific | D143-1 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous | Fisher Scientific | D12345 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC205024 | |
| GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous | Fisher Scientific | AC610941000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 70-011-044 | 10x Concentrated |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -20 °C |
| Triethylamine (TEA) | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | A116-50 | |
| Tumor measuring device | Peira TM900 | Peira TM900 |
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