Levure comme un châssis pour le développement des essais fonctionnels pour étudier l'homme P53

Summary

Présenté ici sont quatre protocoles pour construire et exploiter la levure Saccharomyces cerevisiae reporter souches pour étudier le potentiel humain de transactivation P53, les impacts de ses diverses mutations associées au cancer, co-exprimé protéines d’interaction, et les effets de petites molécules spécifiques.

Abstract

La découverte que la protéine bien connue des mammifères P53 peut agir comme facteur de transcription (TF) dans la levure S. cerevisiae a permis le développement de différentes analyses fonctionnelles pour étudier les impacts du site de liaison 1) [c.-à-d., élément de réponse (RE)] variantes de séquence sur la spécificité de transactivation de P53 ou 2) mutations de TP53, co-facteurs exprimés, ou petites molécules sur l’activité de transactivation de P53. Différentes applications de recherche de base et translationnelles ont été développées. Expérimentalement, ces approches exploitent deux avantages majeurs du modèle de levure. D’une part, la facilité d’édition du génome permet la construction rapide de systèmes de reporter qualitatifs ou quantitatifs en exploitant des souches isogéniques qui ne diffèrent qu’au niveau d’un P53-RE spécifique pour étudier la spécificité de la séquence de La transactivation. D’autre part, la disponibilité de systèmes réglementés pour l’expression ectopique P53 permet l’évaluation de la transactivation dans un large éventail d’expression protéique. Les systèmes largement utilisés qui sont basés sur les gènes des journalistes de couleur, la luciferase et la croissance de la levure pour illustrer leurs principales étapes méthodologiques et évaluer de façon critique leur pouvoir prédictif sont examinés dans ce rapport. En outre, l’extrême polyvalence de ces approches peut être facilement exploitée pour étudier différents TFs, y compris P63 et P73, qui sont d’autres membres de la famille des gènes TP53.

Introduction

La transcription est un processus extrêmement complexe impliquant l’organisation dynamique, spatiale et temporelle des facteurs de transcription (TFs) et des cofacteurs pour le recrutement et la modulation des polymérases d’ARN sur des régions de chromatine en réponse aux stimulus spécifiques¹ . La plupart des TF, y compris le suppresseur humain de tumeur de P53, reconnaissent les éléments cis-action spécifiques sous la forme des séquences d’ADN appelées éléments de réponse (REs), qui se composent des motifs uniques (ou multiples) uniques de 6-10 nucléotides longs. Dans ces motifs, les positions individuelles peuvent montrer divers degrés de variabilité², généralement résumépar par matrices de poids de position (PWM) ou logos^3,4.

La levure S. cerevisiae est un système modèle approprié pour étudier différents aspects des protéines humaines par des essais de complémentarité, l’expression ectopique, et les essais fonctionnels, même quand un gène de levure orthologue n’est pas présent^{5, 6} Annonces ^{, 7}. En raison de la conservation évolutive des composants basaux du système transcriptionnel⁸, de nombreux TF humains (lorsqu’ils s’expriment ectopiquement dans les cellules de levure) peuvent moduler l’expression d’un gène journaliste en agissant par l’intermédiaire de promoteurs contiennent des RE appropriés. Le système de modèle de transcription présenté ici pour l’homme P53 est caractérisé par trois variables principales dont les effets peuvent être modulés : 1) la modalité d’expression et le type de P53, 2) la séquence RE contrôlant la transcription P53-dépendante, et 3) le type de gène journaliste (Figure 1A).

En ce qui concerne la modalité de l’expression P53, S. cerevisiae permet le choix des promoteurs inductibles, répressibles ou constitutifs^9,10,11. En particulier, le promoteur inductible GAL1 permet l’expression basale (en utilisant le raffinose comme source de carbone) ou variable (en changeant la quantité de galactose dans les médias) d’une TF en levure. En fait, l’expression finement réglable représente un développement critique pour l’étude non seulement P53 lui-même, mais aussi d’autres protéines de la famille P53^12,13.

En ce qui concerne le type de R contrôlant l’expression P53-dépendante, S. cerevisiae permet la construction de différentes souches de reporter possédant des différences uniques dans l’ER d’intérêt dans un fond autrement isogénique. Cet objectif est atteint à l’aide d’une adaptation d’une approche d’édition du génome particulièrement polyvalente développée en S. cerevisiae, appelée delitto perfetto^12,14,15,16.

En outre, différents gènes de reporter (c.-à-d., URA3, HIS3, et ADE2) peuvent être employés pour évaluer qualitativement et quantitativement des activités transcriptionnelles des TF humains dans S. cerevisiae,chacun avec des dispositifs spécifiques qui peuvent être adapté aux besoins expérimentaux^{17,18,19,20,21}. L’expression de ces gènes de journaliste confère uracil, histidine, et prototrophy d’adénine, respectivement. Le journaliste URA3 ne permet pas la croissance des cellules en présence de 5-FOA ainsi, et donc il peut être contre-sélectionné. Le système de reporter ADE2 a l’avantage qu’en plus de la sélection nutritionnelle, il permet l’identification de cellules de levure qui expriment des cellules sauvages (c.-à-d. fonctionnelles sur l’expression ADE2) ou mutantes (c.-à-d.,non fonctionnelles sur ADE2 ) P53 de la couleur de la colonie.

Par exemple, les cellules de levure exprimant le gène ADE2 génèrent des colonies blanches de taille normale sur des plaques contenant des quantités limitantes d’adénine (2,5-5,0 mg/L), tandis que celles qui le transcrivent mal ou ne le transcrivent pas apparaissent sur la même plaque que les plus petites rouges (ou roses) Colonies. Ceci est dû à l’accumulation d’un intermédiaire dans la voie biosynthétique adénine (c.-à-d., P-ribosylamino-imidazole, qui a été précédemment appelé ribotide amino-imidazole ou AIR), qui est converti pour former un pigment rouge. Le gène de journaliste ADE2 basé sur la couleur qualitative a depuis été remplacé par le quantitatif Firefly Photinus pyralis (LUC1)^12,22. Plus récemment, le journaliste de l’ADE2 a été associé au journaliste de lacZ dans un essai facile à marquer, semi-quantitatif, double reporter qui peut être exploité pour sous-classer les mutants P53 en fonction de leur niveau résiduel de fonctionnalité ²³.

Des reporters fluorescents tels que l’EGFP (protéine fluorescente verte améliorée) ou DsRed (protéine fluorescente rouge de Discosoma sp. ont également été employés pour l’évaluation quantitative de l’activité de transactivation liée à toutes les mutations de mauvais sens possibles dans le TP53 séquence de codage²⁴. Enfin, la possibilité de combiner les promoteurs réglables pour l’expression de l’allèle P53 avec des souches de levure isogéniques différentes pour le gène RE et/ou reporter a conduit au développement d’une matrice de données qui génère une classification raffinée des souches de levure sérogènes et germinales associées au cancer. mutant P53 alleles^25,26,27.

Les approches décrites ci-dessus sont utilisées pour mesurer l’activité transcriptionnelle de la protéine P53. Cependant, l’expression de type sauvage P53 dans la levure S. cerevisiae²⁸ et Schizosaccharomyces pombe²⁹ peut causer un retard de croissance, qui a été associé à l’arrêt du cycle cellulaire^28,30 ou mort cellulaire³¹. Dans les deux cas, l’inhibition de croissance de levure est déclenchée par l’expression élevée de P53 et a été corrélée avec la modulation transcriptionnelle potentielle des gènes endogènes de levure impliqués dans la croissance cellulaire. À l’appui de cette hypothèse, le mutant P53 R273H, qui a perdu sa fonction, n’a pas interféré avec la croissance des cellules de levure lorsqu’il est exprimé à des niveaux similaires à ceux du P53^32. Inversement, l’expression dans la levure du mutant toxique P53 V122A (connu pour une activité transcriptionnelle plus élevée par rapport à la nature sauvage P53) a causé un effet inhibiteur de croissance plus fort que le type sauvage P53³².

En outre, il a été démontré que l’homme MDM2 était capable d’inhiber l’activité transcriptionnelle humaine P53 dans la levure, favorisant son ubiquitination et la dégradation subséquente³³. En conséquence, la capacité de MDM2 et de MDMX humains d’inhiber l’inhibition de croissance de levure P53-induite a été démontrée^32,34. Dans une étude supplémentaire, une corrélation entre l’activité transcriptionnelle P53 et les niveaux d’expression d’actine a été établie, avec l’identification d’un P53 RE putatif en amont sur le gène ACT1 dans la levure³². Constamment, l’expression d’actine a été renforcée par le type sauvage P53 et encore plus par P53 V122A, mais pas par mutant P53 R273H. Inversement, l’expression d’actine par P53 a diminué dans la co-présence des inhibiteurs de P53 MDM2, MDMX, ou pifithrin-MD (un inhibiteur de petite molécule de l’activité transcriptionnelle de P53), compatible avec des résultats basés sur l’analyse de levure-croissance. Fait important, ces résultats ont établi une corrélation entre l’inhibition de la croissance induite par P53 et le degré de son activité dans la levure, qui a également été exploitée pour identifier et étudier de petites molécules modulant les fonctions P53^{28,34 , 35}.

Protocol

1. Construction de souches de levure aDE2 ou LUC1 contenant un RE spécifique (yAFM-RE ou yLFM-RE) Streak a yAFM-ICORE ou yLFM-ICORE souche12,14 (ICORE – I, ISce-I endonuclease sous GAL1 promoteur; CO et contre URA3sélectionnable ; RE – journaliste KanMX4 conférant la résistance de kanamycine ; Tableau 1) à partir d’un stock de glycérol de 15 % stocké à -80 oC sur une plaque d’agar YPD…

Representative Results

Construction de ADE2 (En) ou LUC1 LUC1 souches de levure journaliste Ledelitto perfettoapproach12,14,15,16 a été adapté pour permettre la construction de souches de levure squelin P53 repo…

Discussion

Les essais à base de levure se sont avérés utiles pour étudier divers aspects des fonctions protéiques P53. Ces essais sont particulièrement sensibles pour évaluer le potentiel de transactivation P53 vers des variantes de sites cibles RE, y compris l’évaluation des polymorphismes fonctionnels. L’utilisation de journalistes de couleur ainsi que la miniaturisation de l’analyse de la luciférase se traduisent par des essais rentables et relativement évolutifs. En outre, le test d’inhibition de la croissance est pot…

Materials

L-Aspartic acid	SIGMA	11189
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
L-Phenylalanine	SIGMA	78019
Peptone	BD Bacto	211677
Yeast ex+A2:C26tract	BD Bacto	212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate	BDTM	233520
Lithium Acetate Dihydrate	SIGMA	517992
Bacteriological Agar Type A	Biokar Diagnostics	A1010 HA
G418 disulfate salt	SIGMA	A1720
Ammonium Sulfate	SIGMA	A2939
L-Arginine Monohydro-chloride	SIGMA	A5131
Adenine Hemisulfate Salt	SIGMA	A9126
Passive Lysis Buffer 5x	PROMEGA	E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System	PROMEGA	E2620
5-FOA	Zymo Research	F9001
D-(+)-Galactose	SIGMA	G0750
L-Glutamic acid	SIGMA	G1251
Dextrose	SIGMA	G7021
L-Histidine	SIGMA	H8125
L-Isoleucine	SIGMA	I2752
L-Lysine	SIGMA	L1262
L-Leucine	SIGMA	L8000
L-Methionine	SIGMA	M2893
PEG	SIGMA	P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate	SIGMA	R0250
L-Serine	SIGMA	S4500
L-Tryptophan	SIGMA	T0271
L-Threonine	SIGMA	T8625
Uracil	SIGMA	U0750
L-Valine	SIGMA	V0500