微电极镀膜法记录从可吸入性中脑动脉的膜电位

Summary

本文的主要目的是提供如何使用微电极浸渍法记录中脑动脉膜电位(Vm)的详细信息。可加法的中脑动脉得到平衡,以获得造血性音,使用高电阻微电极刺穿血管壁。

Abstract

血管平滑肌细胞的膜电位 (V_m) 决定血管张力,从而决定血液流向器官。在疾病条件下调节V_m的电通道和电源泵的表达和功能的变化可能会改变V m、血管张力和血流。因此,对电生理学的基本理解和准确记录V_m在健康和疾病状态的必要方法是必不可少的。这种方法将允许使用不同的药理剂调制V_m以恢复V m。虽然有几种方法,各有其优缺点,本文提供了使用微电极浸渍法记录从罐化阻力血管(如中脑动脉)的V_m的协议。中脑动脉在造血室中获得造血性,血管壁使用高电阻微电极。V_m信号通过静电计进行收集、数字化和分析。该方法提供血管壁V_m的精确读数,不损坏细胞,也无需改变膜电阻。

Introduction

细胞的膜电位(V_m)是指等离子膜中离子电荷的相对差异以及膜对这些离子的相对渗透性。V_m由离子差分分布生成,并由离子通道和泵维护。Ion通道,如K+,Na+和Cl⁺对休息的V_m贡献很大。血管平滑肌细胞 (VSMC) 表示四种以上不同类型的 K⁺通道^1,两种类型的电压门控 Ca²⁺通道 (VGCC)^2,两种以上的 Cl⁺通道^3,4,5、储存操作的 Ca²⁺通道 6、拉伸激活的阳离子通道7、8 和电原钠-钾 ATPase 泵⁹在其等离子膜中,所有这些都可能是参与V_m的管制。

VSMC 的 V_m取决于流明压力。在非加压容器中,V_m从 -50 到 -65 mV 不等,但在加压动脉段,V_m范围为 -37 到 -47 mV¹⁰。血管内压力升高导致VSMC去极化11,降低VGCC开口的阈值,并增加钙的流入,促进肌原性^音调12的发展。相反,在被动或非加压容器中,由于高K+通道活性,膜超极化会阻止VGCC打开,导致钙进入受限和细胞内钙的减少,导致血管^音13.因此,V_m由于流明压力的变化似乎在血管张力发展中起着至关重要的作用,而VGCC和K+通道在V_m的调节中起着至关重要的作用。

V_m因容器类型和物种而异。V_m是 -54 × 1.3 mV 在豚鼠优越的脑动脉条^14,-45 × 1 mV 在大鼠中脑动脉在 60 mmHg 流明压力^12,和 -35 × 1 mV 在大鼠腹腔动脉在 40 mmHg 流明压力¹⁵.未拉伸大鼠淋巴肌肉记录的休息 V_m是 -48 × 2 mV¹⁶。脑VSMC的V_m比外周动脉更负。相比之下,据报道,猫科脑动脉的V_m约为-70 mV,而据报道,脑动脉和冠状动脉分别有-49和-58 mV,分别为17、18。血管病床V_m的差异可能反映了电通道和电基钠钾泵的表达和功能的差异。

V_m中的增减分别称为膜去极化和超极化。V_m中的这些变化在许多生理过程中起着核心作用,包括电道门控、细胞信号、肌肉收缩和运动电位传播。在固定压力下,许多激活K+通道的内源和合成血管扩张剂化合物导致膜超极化,导致血管化1,13。相反,持续膜脱极极基在激动剂诱导或受体介导的血管^收缩19中至关重要。V_m是一个关键变量,它不仅通过 VGCC¹³调节 Ca²⁺流入,还影响内部存储^20、21和 Ca²⁺的 Ca²⁺的释放,合同^装置22。

虽然有几种方法可以记录不同细胞类型的V m,但从罐体容器的微电极浸渍法收集的数据似乎比从分离的VSMC获得的数据更具生理性。当使用电流钳位方法从隔离的VSMC中记录时,V_m在VSMC24中被视为自发瞬态超极化。隔离的VSMC不在同步体中,串联电阻的变化可能导致V_m的振荡行为。另一方面,当从完整血管记录V_m时,振荡行为是不能观察到的,这可能是由于VSMC之间的细胞接触,这些细胞在动脉中是同步的,并且在整个血管中求和,导致稳定的V_m ^24.因此,使用标准微电极浸渍技术从加压容器测量V m,与生理条件相对接近。

从可分离的血管记录V_m可以提供重要信息,因为同步的VSMC的V_m是血管音调和血流的主要决定因素之一,而V_m的调制可以提供一种拉升或收缩血管。因此,了解记录 V_m所涉及的方法至关重要。本文使用微电极浸渍法描述了从可熔化中脑动脉(MCA)的V_m细胞内记录。该协议将描述如何准备MCA,微电极,设置电表,并执行记录V_m的浸渍方法。此外,还讨论了代表性数据、使用此方法时遇到的常见问题和潜在问题。

Protocol

雄性大鼠被安置在UMMC的动物护理设施中,该设施得到实验室动物护理评估和认证协会(AAALAC)的批准。在整个研究中,动物可以免费获得食物和水。动物在受控环境中保持温度为24~2°C,湿度水平为60~80%,光/暗循环为12小时。所有协议均获得UMMC动物护理和使用委员会的批准。 1. 设备准备 将双通道差分仪电表放大器(参见材料表)靠近容器室和所需位置。 使用…

Representative Results

该方法可以可靠地用于在罐式容器中记录Vm。图1A中介绍了一个描述如何从大脑中分离MCA的简要过程。将大脑与头骨分离后,MCA被解剖出来,并放置在含有低钙PSS的培养皿中。附加的部分结缔组织也使用弹簧剪刀和钳子与 MCA 一起解剖,以防止在隔离过程中对 MCA 造成损伤。仔细,结缔组织也被移除,解剖的MCA准备转移到近影。MCA 安装在导管上,在表?…

Discussion

本文提供了如何使用锋利的微电极浸渍法从罐化容器制备中记录V_m的必要步骤。该方法被广泛使用,并提供高质量、一致的V_m记录,回答广泛的实验问题。

此处介绍了一些关键注意事项和故障排除步骤,以确保该方法成功。微电极的质量(其锐度和电阻)及其穿透的细胞过程影响V_m的稳定性和精度。如果信号持续漂移或高于或低于放大器的录制范围,则极有可?…

Materials

Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761