Microelectrode Impalement विधि एक Cannulated मध्य सेरेब्रल धमनी से झिल्ली क्षमता रिकॉर्ड करने के लिए
Summary
इस आलेख का प्राथमिक लक्ष्य माइक्रोइलेक्ट्रोड इम्पेमेंट विधि का उपयोग करके मध्य मस्तिष्क धमनी से झिल्ली की क्षमता (Vउ) को रिकॉर्ड करने का विवरण प्रदान करना है। कैनाक्यूटेड मध्य सेरेब्रल धमनी मायोजेनिक टोन हासिल करने के लिए साम्य ित है, और पोत की दीवार उच्च प्रतिरोध microelectrodes का उपयोग कर impaled है।
Abstract
संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की झिल्ली क्षमता (वीमी) वाहिका टोन निर्धारित करता है और इस प्रकार एक अंग के लिए रक्त प्रवाह. आयन चैनलों और इलेक्ट्रोजेनिक पंपों की अभिव्यक्ति और समारोह में परिवर्तन जो रोग की स्थिति में Vm को विनियमित करते हैं, संभवतः Vm, संवहनी टोन, और रक्त प्रवाह को बदल सकते हैं। इस प्रकार, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की बुनियादी समझ और स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों में टच को सही ढंग से रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक विधियाँ आवश्यक हैं। इस विधि से विभिन्न औषधीय अभिकर्ताओं का उपयोगकरके Vm को पुनर्स्थापित करने में नियमन की अनुमति होगी। हालांकि वहाँ कई तरीके हैं, इसके फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक, इस लेख ऐसे microelectrode impalement विधि का उपयोग कर मध्य मस्तिष्क धमनी के रूप में cannulated प्रतिरोध वाहिकाओं से वीमीटर रिकॉर्ड करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है. मध्य मस्तिष्क धमनियों एक मायोग्राफ कक्ष में myogenic टोन हासिल करने के लिए अनुमति दी जाती है, और पोत की दीवार उच्च प्रतिरोध microelectrodes का उपयोग कर impaled है. Vm संकेत एक इलेक्ट्रोमीटर के माध्यम से एकत्र किया जाता है, डिजीटल, और विश्लेषण किया. इस विधि कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए बिना और झिल्ली प्रतिरोध को बदलने के बिना एक पोत की दीवार के वीमीटर का एक सटीक पढ़ने प्रदान करता है.
Introduction
किसी कोशिका की झिल्ली विभव (टब) प्लाज्मा झिल्ली के पार आयनिक आवेश के सापेक्ष अंतर तथा इन आयनों के लिए झिल्ली की सापेक्ष पारगम्यता को संदर्भित करता है। टट आयनों के विभेदक वितरण द्वारा उत्पन्न होता है और आयन चैनलों और पम्पों द्वारा इसका रखरखाव किया जाता है। आयन चैनल जैसे के+, ना+और क्लमके चैनल आराम करने वाले वी. एम. में काफी योगदान देते हैं . संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) कश्मीर के चार से अधिक विभिन्न प्रकार के व्यक्त+ चैनल1, वोल्टेज gated Ca 2 के दो प्रकारके चैनल (VGCC)2, सीएल के दो से अधिक प्रकार के चैनल3, 4 , 5, स्टोर संचालित Ca2 + चैनल6, खिंचाव सक्रिय धन चैनल7,8, और इलेक्ट्रोजेनिक सोडियम-पोटेशियम ATPase पंप9 उनके प्लाज्मा झिल्ली में, जिनमें से सभी हो सकता है Vmके विनियमन में शामिल .
वीएसएमसी का टट ल् ल्यूमेन दाब पर निर्भर करता है। गैर-दाबित वाहिकाओं में, Vm -50 से -65 एमवी तक भिन्न होता है, तथापि, दाबित धमनी खंडों में, वीएम की रेंज -37 से -47 एमवी10तक होती है। इंट्रावास्कुलर दबाव की ऊंचाई के कारण वीएसएमसी11को अस्थिर कर देता है , वीजीसीसी खोलने के लिए सीमा को कम करता है , और मायोजेनिक टोन12के विकास में योगदान देने वाले कैल्शियम की आमद को बढ़ाता है। इसके विपरीत, निष्क्रिय या गैर दबाव वाले जहाजों में, उच्च कश्मीर+ चैनल गतिविधि के कारण झिल्ली hyperpolarization, खोलने से VGCC को रोकने जाएगा, सीमित कैल्शियम प्रवेश और intracellular कैल्शियम में कमी में जिसके परिणामस्वरूप, कम करने के लिए योगदान संवहनी टोन13| अतः लुमेन दाब में परिवर्तन के कारण टच, संवहनी स्वर विकास में एक आवश्यक भूमिका निभाताप्रतीत होता है तथा वीजीसीसी तथाके ़ दोनों चैनल ट के विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
Vm पोत प्रकार और प्रजातियों के बीच भिन्न होता है। वीउ है -54 – 1.3 एमवी गिनी पिग में बेहतर mesenteric धमनी स्ट्रिप्स14, -45 – चूहा मध्यम मस्तिष्क धमनियों में 60 mmHg लुमेन दबाव12, और -35 ] चूहे पैरेन्काइम धमनियों में 40 मिमीएचजी लुमेन दबाव15. आराम वीमीटर unstretched चूहे लसीका मांसपेशी में दर्ज की गई है -48 – 2 mV16. सेरेब्रल वीएसएमसी का वीमी परिधीय धमनियों की तुलना में अधिक नकारात्मक होता है। इसकी तुलना में, बिल्ली के मध्य मस्तिष्क ीय धमनियों में लगभग -70एमवी का वी होने की सूचना मिली थी, जबकि मध्याह्न और कोरोनरी धमनियों में क्रमशः -49 और -58 एमवी , क्रमश:17,18थे। संवहनी बिस्तरों में वीच में अंतर आयन चैनलों और इलेक्ट्रोजेनिक सोडियम-पोटेशियम पंपों की अभिव्यक्ति और कार्य में अंतर को प्रतिबिंबित कर सकता है।
वृद्धि और टमें कमी क्रमशः झिल्ली depolarization और hyperpolarization के रूप में संदर्भित कर रहे हैं। वीएम में ये परिवर्तन कई शारीरिक प्रक्रियाओं में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, जिसमें आयन-चैनल गैटिंग, सेल सिग्नलिंग, मांसपेशी संकुचन, और कार्रवाई क्षमता का प्रसार शामिल है। एक निश्चित दबाव पर, कई अंतर्जात और सिंथेटिक वासोडिलेटर यौगिकों जो K+ चैनलों को सक्रिय करते हैं, झिल्ली hyperpolarization का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप वासोडिलेशन1,13. इसके विपरीत, निरंतर झिल्ली depolarization एगोनिस्ट प्रेरित या रिसेप्टर मध्यस्थता vasoconstriction19में महत्वपूर्ण है. Vm एक महत्वपूर्ण चर है कि न केवल VGCC13 के माध्यम से Ca2 + प्रवाह को नियंत्रित करता है, लेकिन यह भी आंतरिक दुकानों से Ca 2+ की रिहाई को प्रभावित करती है20,21 और Ca 2+– संवेदनशीलता की संकुचन तंत्र22|
जबकि विभिन्न सेल प्रकारों से Vm को रिकॉर्ड करने के लिए कई विधियाँ हैं, कनपरिकलित वाहिकाओं के माइक्रोइलेक्ट्रोलेड इम्पेमेंट विधि से एकत्र किए गए डेटा अलग-अलग VSMCs से प्राप्त आंकड़ों की तुलना में अधिक शारीरिक प्रतीत होते हैं। जब अलग VSMC से वर्तमान क्लैम्प तरीकों का उपयोग कर दर्ज की गई, वीवी एस एम एस24में स्वत: क्षणिक hyperpolarizations के रूप में देखा जाता है. पृथक वीएसएमसी सिंकिशियम में नहीं हैं, और श्रृंखला प्रतिरोध में परिवर्तन टटके दोलनात्मक व्यवहार में योगदान दे सकते हैं। दूसरी ओर, जब वीउ बरकरार जहाजों से दर्ज किया जाता है, तो दोलनव्यवहार व्यवहार नहीं देखा जाता है, शायद वीएसएमसी के बीच सेल-सेल संपर्क के कारण जो धमनी में सिंकिटियम में होते हैं और पूरे पोत में एक स्थिर वीउ के लिए अभिमनित होते हैं। 24इस प्रकार मानक माइक्रोइलेक्ट्रोड इम्पेमेंट तकनीक का उपयोग करके दाबित वाहिकाओं से टच का माप अपेक्षाकृत शारीरिक स्थितियों के निकट होता है।
cannulated जहाजों से वीएम रिकॉर्डिंग महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है, के बाद से VSMCs के वी एम एसकि syncytium में हैं संवहनी टोन और रक्त प्रवाह के प्रमुख निर्धारकों में से एक है, और वीएम के मॉडुलन एक तरह से फैलाने के लिए प्रदान कर सकता है या रक्त वाहिकाओं को संकुचित करें। इस प्रकार, टचको रिकॉर्ड करने में शामिल पद्धति को समझना आवश्यक है। यह आलेख एक microelectrode impalement विधि का उपयोग कर cannulated मध्य मस्तिष्क धमनियों (एमसीए) से वीमीटर की इंट्रासेल्यूलर रिकॉर्डिंग का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में यह वर्णन किया जाएगा कि एमसीए, माइक्रोइलेक्ट्रोड तैयार करने, इलेक्ट्रोमीटर की स्थापना कैसे की जाए और टउको रिकॉर्ड करने के लिए इम्पेलिएमेंट विधि को कैसे निष्पादित किया जाए। साथ ही, प्रतिनिधि डेटा, सामान्य समस्याओं जो इस विधि और संभावित समस्याओं का उपयोग करते समय सामना किया गया चर्चा है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह आलेख एक cannulated पोत तैयारी से Vm रिकॉर्ड करने के लिए एक तेज microelectrode impalement विधि का उपयोग करने के लिए कैसे पर आवश्यक चरण प्रदान करता है। इस विधि को व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है, और वीएम की उच्च गुणवत्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के भाग में UMMC से Intramural समर्थन अनुसंधान कार्यक्रम (IRSP) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, AHA वैज्ञानिक विकास अनुदान (13SDG14000006) मल्लिकार्जुन आर Pabbidi को सम्मानित किया.
Materials
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
- Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
- Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).
- Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
- Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
- Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).
- Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).
- Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
- Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).
- Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).
- Coca, A., Garay, R. . Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , (1993).
- Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).
- Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).
- Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
- Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).
- Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).
- Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).
- Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).
- Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
- Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).
- Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).
- Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
- Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278 (2), C235-C256 (2000).
