एक्स-रे लेसरों में समय-हल सीरियल femtosecond crystallography के लिए माइक्रोक्रिस्टल की उच्च चिपचिपापन बाहर निकालना में सुधार
Summary
एक समय की सफलता का हल सीरियल femtosecond क्रि प्रयोग कुशल नमूना वितरण पर निर्भर है । यहाँ, हम प्रोटोकॉल का वर्णन एक उच्च चिपचिपापन माइक्रो-एक्सट्रूज़न इंटैक्टर से बैक्टीरियोरोहोडोसिन माइक्रोक्रिस्टल के बाहर निकालना का अनुकूलन करने के लिए । कार्यप्रणाली एक उपंयास तीन तरह युग्मक और एक उच्च गति कैमरे के साथ दृश्य के साथ नमूना एकरूपता पर निर्भर करता है ।
Abstract
उच्च चिपचिपापन माइक्रो-बाहर निकालना इंजेक्टर नाटकीय रूप से एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेसरों (xfels) में सीरियल femtosecond क्रिस्टलीय प्रयोगों (sfx) में नमूना खपत कम कर दिया है । प्रकाश चालित प्रोटॉन पम्प बैक्टीरियोर्होडोसिन का उपयोग करके प्रयोगों की एक श्रृंखला ने इन इंजेक्टर को समय के लिए क्रिस्टल देने के लिए एक पसंदीदा विकल्प के रूप में स्थापित किया है-हल किए गए सीरियल femtosecond क्रि (TR-sfx) के संरचनात्मक परिवर्तन को हल करने के लिए photoactivation के बाद प्रोटीन । उच्च गुणवत्ता के कई संरचनात्मक स्नैपशॉट प्राप्त करने के लिए, यह डेटा की बड़ी मात्रा में इकट्ठा करने और हर पंप लेजर पल्स के बीच क्रिस्टल की मंजूरी सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । यहाँ, हम विस्तार से वर्णन कैसे हम हमारे हाल ही में TR-sfx प्रयोगों के लिए बैक्टीरियोरोहोडोसिन माइक्रोक्रिस्टल के बाहर निकालना अनुकूलित linac सुसंगत प्रकाश स्रोत (lcls). इस विधि का लक्ष्य एक स्थिर और सतत प्रवाह के लिए बाहर निकालना का अनुकूलन है, जबकि क्रिस्टल की एक उच्च घनत्व को बनाए रखने के लिए दर जिस पर डेटा एक टी. आर. sfx प्रयोग में एकत्र किया जा सकता है बढ़ाने के लिए है । हम एक उपंयास तीन तरह सिरिंज युग्मन डिवाइस का उपयोग कर एक उच्च गति के साथ लिया बाहर निकालना स्थिरता की माप के आधार पर नमूना संरचना समायोजन द्वारा पीछा किया क्रिस्टल का एक समरूप वितरण के साथ lipidic घन चरण की तैयारी करके इस लक्ष्य को प्राप्त कैमरा सेटअप । कार्यप्रणाली को अन्य माइक्रोक्रिस्टल के प्रवाह को अनुकूलित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । सेटअप नए स्विस मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर सुविधा के उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध हो जाएगा ।
Introduction
सीरियल femtosecond क्रि (sfx) एक संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीक है कि एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेसरों (xfel) के अद्वितीय गुणों का दोहन माइक्रोमीटर के हजारों से कमरे के तापमान संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए है-क्रिस्टल आकार जबकि सबसे अधिक outrunning “विनाश से पहले विवर्तन” सिद्धांत1,2,3द्वारा विकिरण क्षति ।
sfx (TR-sfx) के एक समय हल विस्तार में, xfel से femtosecond दालों प्रोटीन में संरचनात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है4,5. ब्याज की प्रोटीन एक ऑप्टिकल लेजर के साथ सक्रिय है (या किसी अन्य गतिविधि ट्रिगर) बस एक पंप-जांच सेटअप में xfel द्वारा गोली मार दी जा रही करने से पहले. ठीक पंप और जांच दालों के बीच देरी को नियंत्रित करके, लक्ष्य प्रोटीन विभिन्न राज्यों में कब्जा कर लिया जा सकता है । समय में परिमाण के ग्यारह आदेश पर संरचनात्मक परिवर्तन की आणविक फिल्मों के कई प्रोटीन लक्ष्य की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए नए xfel स्रोतों की शक्ति का प्रदर्शन6,7,8,9, 10,11,12,13. मुख्य रूप से, विधि गतिशील स्पेक्ट्रोस्कोपिक और स्थैतिक संरचनात्मक तकनीकों को एक में जोड़ता है, निकट परमाणु संकल्प में प्रोटीन गतिशीलता में एक झलक प्रदान करता है ।
TR-sfx के लिए सरल प्रणालियों में रेटिनल की तरह एक फोटो-संवेदी घटक के साथ सक्रियण का एक अंतर्जात ट्रिगर हो सकता है बैक्टीरियोरहोडोप्सिन (bR)9,10, फोटोसिस्टम द्वितीय में क्रोमोफोर्स12,13, photoactive पीला प्रोटीन (pyp)6,7 वापस photoswitchable फ्लोरोसेंट प्रोटीन11, या एक photolyzable कार्बन मोनोऑक्साइड में मायोगोलोबिन8। तकनीक के रोमांचक रूपांतरों अभी भी विकास में मिश्रण पर भरोसा करते हैं और योजनाओं14,15 एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए या एक इलेक्ट्रिक क्षेत्र संरचनात्मक परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया16. यह देखते हुए कि xfel सूत्रों केवल कुछ वर्षों के लिए उपलब्ध है और भविष्य में पिछले सफलताओं extrapolating, विधि एक असली खेल के रूप में क्षमता से पता चलता है कि कैसे प्रोटीन समारोह की हमारी समझ के संबंध में परिवर्तक ।
क्योंकि जैविक नमूनों एक उच्च शक्ति xfel पल्स करने के लिए एक ही जोखिम से नष्ट कर रहे हैं, प्रोटीन क्रि के लिए नए दृष्टिकोण आवश्यक थे । इन प्रक्रियाओं के अलावा,17,18,19विकसित किया जा करने के लिए आवश्यक वर्दी microक्रिस्टलों की बड़ी मात्रा बढ़ने की क्षमता । एक xfel पर डेटा संग्रह को सक्षम करने के लिए, इन क्रिस्टल वितरित किया जाना चाहिए, छोड़ दिया, और फिर प्रत्येक xfel पल्स के लिए नवीनीकृत । यह देखते हुए कि xfels आग 10-120 हर्ट्ज पर प्रयोग करने योग्य दालों, नमूना वितरण तेजी से होना चाहिए, स्थिर, और विश्वसनीय, जबकि भी क्रिस्टल बरकरार रखने और खपत सीमित. सबसे सफल समाधानों में से एक उच्च चिपचिपापन माइक्रो-एक्सट्रूज़न इंजैक्टर है, जो स्पंदित एक्स-रे बीम20के पार कमरे के तापमान क्रिस्टल-लादेन lipidic घन चरण (lcp) के एक continiously स्ट्रीमिंग कॉलम बचाता है । बेतरतीब ढंग से उन्मुख क्रिस्टल, lcp स्ट्रीम में एम्बेडेड, कि xfel दलहन तितर-बितर एक्स-किरणों एक डिटेक्टर पर जहां एक विवर्तन पैटर्न दर्ज किया गया है द्वारा रोक रहे हैं. lcp एक नमूना वितरण माध्यम के लिए एक प्राकृतिक विकल्प था क्योंकि यह अक्सर झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल के लिए एक विकास माध्यम के रूप में प्रयोग किया जाता है17,21,22,23, अभी तक अन्य उच्च चिपचिपापन वाहक मीडिया 24,25,26,27,28,29,30 और घुलनशील प्रोटीन31 भी सुई लगानेवाला में इस्तेमाल किया गया है । उच्च चिपचिपापन सुई लगानेवाला के साथ sfx झिल्ली प्रोटीन की संरचना निर्धारण के दौरान सफल रहा है13,३२ जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स सहित (gpcrs)३३,३४, ३५,३६,३७, समय और नमूना कुशल दोनों जा रहा है जबकि देशी चरणबद्ध३८,३९ के लिए पर्याप्त डेटा गुणवत्ता के साथ. वर्तमान में, इन इंजेक्टर सिंक्रोट्रॉन स्रोतों पर कमरे के तापमान मापन के लिए और अधिक नियमित रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है28,30,४०,४१ के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में अधिक तकनीकी रूप से xfels9,10,13,४२में TR-sfx प्रयोगों की मांग ।
तुलनीय TR-sfx प्रयोगों एक प्रवाह केंद्रित नोक6,7,12में तरल चरण वितरण की तरह अन्य इंटैक्टर प्रकार का उपयोग किया गया है, हालांकि, इस विधि प्रोटीन मात्रा के लिए कई उपलब्ध नहीं है की आवश्यकता जैविक रूप से दिलचस्प लक्ष्य । चिपचिपा बाहर निकालना का उपयोग कर स्थैतिक संरचनाओं के निर्धारण के लिए ०.०७२ प्रति प्रोटीन के मिलीग्राम की औसत खपत १०,००० अनुक्रमित विवर्तन पैटर्न की तुलना में ९.३५ मिलीग्राम तरल जेट नलिका के लिए सूचित किया गया है (यानी, के बारे में १३० बार अधिक नमूना दक्ष)20. उच्च चिपचिपापन इंटैक्टर TR-sfx के लिए एक व्यवहार्य नमूना वितरण उपकरण होने के लिए दिखाया गया है जबकि केवल इस नमूना दक्षता४३के कुछ त्याग । nogly एट अल में (२०१८)10, उदाहरण के लिए, नमूना खपत के बारे में था १.५ १०,००० अनुक्रमित पैटर्न प्रति मिलीग्राम, जो समान TR-sfx प्रयोगों के लिए अनुकूल तुलना pyp जहां औसत नमूना उपभोग के साथ बहुत अधिक था ७४ प्रति प्रोटीन की मिलीग्राम १०,००० अनुक्रमित पैटर्न6। उच्च चिपचिपापन इंजेक्टर इस प्रकार स्पष्ट लाभ है जब उपलब्ध प्रोटीन की मात्रा सीमित है या जब क्रिस्टल सीधे lcp में उगाया जाता है ।
टी. आर.-sfx के लिए उच्च चिपचिपापन इंजेक्टर का उपयोग करने के लिए सबसे विश्वसनीय डेटा कई तकनीकी मुद्दों को संबोधित किया जाना चाहिए उपज: प्रवाह की गति के लिए एक ंयूनतम महत्वपूर्ण मूल्य से ऊपर रहने की जरूरत है; हिट-दर को उस स्तर पर बनाए रखा जाना चाहिए जो डेटा संग्रह को धीमा नहीं करता है (उदा., 5% से अधिक); और नमूना अत्यधिक अवरोधों के बिना डिलीवर किया जाना चाहिए । आदर्श रूप में, इन शर्तों को पहले से ही एक अनुसूचित TR-sfx प्रयोग के लिए उपलब्ध xfel समय के रूप में कुशलता से संभव के रूप में उपयोग करने से पहले मिले हैं । pricipally, lcp स्ट्रीम में मंदी क्रिस्टल है कि एक से अधिक ऑप्टिकल लेजर पल्स और मिश्रित सक्रिय राज्यों में परिणाम के साथ सक्रिय थे की जांच की अनुमति हो सकती है, या पंप सामग्री की जांच जब umpumped सामग्री बीम में उंमीद है । इंजेक्शन पूर्व परीक्षण का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि एक xfel पर डेटा संग्रह के दौरान डाउनटाइम भरा हुआ नलिका की जगह के लिए समय जनमानस के रूप में कम है, बाहर गैर extruding नमूनों को बदलने, और अन्य रखरखाव कार्य कम है.
यहाँ, हम एक उच्च चिपचिपापन माइक्रो-एक्सट्रूज़न इंटैक्टर के साथ TR-sfx डेटा संग्रह के लिए नमूना वितरण का अनुकूलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । सादगी के लिए, वर्णित तरीकों एक एक्स-रे स्रोत के लिए उपयोग पर भरोसा नहीं करते हैं, हालांकि एक सिंक्रोट्रॉन बीएमलाइन पर काम29 अपेक्षित हिट दरों और क्रिस्टल विवर्तन के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करेगा. हमारे प्रोटोकॉल्स को प्रोटॉन-पम्प बैक्टीरियोरोडोसिन10 में रेटिना आइसोमेराइजेशन को कैप्चर करने के लिए प्रयोगों का अनुकूलन करने के लिए विकसित किया गया है और एक्सट्रूज़न की निगरानी के बाद एक्सट्रूज़न के लिए क्रिस्टल नमूनों को तैयार करने के साथ शुरू होने वाले दो चरणों में किए जाते हैं एक उच्च गति कैमरा सेटअप का उपयोग करना । एक चरण में, क्रिस्टल-लादेन lcp अतिरिक्त lcp के साथ मिलाया जाता है, कम संक्रमण तापमान लिपिड, या अन्य additives अंतिम मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए कॉलेस्ट्रॉल या धीमा के बिना नमूना वातावरण में वितरण के लिए उपयुक्त है. एक नया तीन तरह सिरिंज युग्मक मिश्रण प्रदर्शन और नमूना एकरूपता में सुधार करने के लिए विकसित किया गया था. दूसरे चरण में एक बाहर निकालना परीक्षण के एक उच्च गति कैमरे द्वारा दर्ज सीधे बाहर निकालना गति स्थिरता को मापने के लिए होते हैं । वीडियो डेटा के विश्लेषण के बाद, प्रयोगात्मक परिणामों में सुधार करने के लिए नमूना तैयारी प्रोटोकॉल में समायोजन किया जा सकता है । इन प्रक्रियाओं टीटीआर के लिए अन्य प्रोटीन तैयार करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-sfx डेटा संग्रह, न्यूनतम संशोधनों के साथ, और सीमित xfel beamtime के कुशल उपयोग करने के लिए योगदान देगा. नए xfel सुविधाओं के साथ सिर्फ अपने ऑपरेशन४४,४५ और इंजैक्टर-आधारित धारावाहिक डेटा संग्रह विधियों के हस्तांतरण शुरू करने के लिए synchrotrons28,30,४०,४१ , अगले कुछ वर्षों निश्चित रूप से प्रोटीन लक्ष्य की एक कभी व्यापक रेंज की संरचनात्मक गतिशीलता में रोमांचक नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए जारी रहेगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
चिपचिपा बाहर निकालना इंटैक्टर के साथ टी. आर.-sfx विधि बैक्टीरियोरोहोडोसिन9,10 और photosystem द्वितीय13 के संरचनात्मक गतिशीलता अध्ययन के लिए एक व्यवहार्य तकनीक साबित हो गया है और अब ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम gebhard schertler, राफेल abela और साई में उच्च चिपचिपापन इंजेक्टर के उपयोग का समर्थन करने के लिए क्रिस milne स्वीकार करते हैं । रिचर्ड neutze और उनकी टीम समय पर विचार विमर्श के लिए स्वीकार कर रहे है-का समाधान किया क्रि और नमूना वितरण उच्च चिपचिपापन इंजेक्टर का उपयोग कर । वित्तीय सहायता के लिए, हम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन को अनुदान 31003a_141235, 31003a_141235 (जे. एस.) और PZ00P3_174169 (पीएनएस) के लिए स्वीकार करते हैं । इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम मैरी-sklodowska-क्यूरी ग्रांट समझौता नहीं ७०१६४६ के तहत से धन प्राप्त हुआ है ।
Materials
| Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
| Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
| High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
| Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
| Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
| Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
| Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |
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