JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Улучшение экструзии высокой вязкости микрокристаллов для времени решены серийный Фемтосекундный кристаллографии в рентгеновских лазеров

Published: February 28, 2019
doi:
10.3791/59087
, , , , , , , ,
1Division of Biology and Chemistry – Laboratory for Biomolecular Research,Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division – SwissFEL,Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine,Kyoto University, 5Department of Biology,ETH Zürich

Summary

Успех эксперимента кристаллографии времени решены серийный Фемтосекундный зависит от эффективного образца доставки. Здесь мы описываем протоколы для оптимизации экструзионных бактериородопсин микрокристаллов от инжектора микро экструзии высокой вязкости. Методология опирается на пример гомогенизации с Роман трехходовой стяжки и визуализации с помощью высокоскоростной камеры.

Abstract

Высокой вязкости микро экструзии инжекторы резко сократили потребление образца в серийный Фемтосекундный кристаллографических экспериментов (SFX) на свободных электронах рентгеновских лазеров (XFELs). Далее ряд экспериментов с использованием света driven протонного насоса бактериородопсин создали эти форсунки в качестве предпочтительного варианта доставить кристаллы для кристаллографии (TR-SFX) время решена серийный Фемтосекундный решить структурные изменения белки, после photoactivation. Чтобы получить несколько структурных снимки высокого качества, важно для сбора больших объемов данных и обеспечить Распродажа кристаллов между каждый насос лазерного импульса. Здесь мы подробно описать, как мы оптимизировали экструзии бактериородопсин микрокристаллов для нашей недавно TR-SFX экспериментов в Linac последовательной источник света (ССК). Цель метода – оптимизировать экструзии для стабильного и непрерывного потока при сохранении высокой плотности кристаллов для увеличения скорости на которых данные могут быть собраны в TR-SFX эксперимент. Мы достичь этой цели путем подготовки липидный кубической фазы с равномерное распределение кристаллов с помощью Роман трехходовой шприца сцепного устройства, затем регулируя состав образец, основанный на инструментальных замерах стабильности экструзии, с высокоскоростной установки камеры. Методология может быть адаптирована для оптимизации потока микрокристаллов других. Установка будет доступна для пользователей данного объекта Новый швейцарский бесплатно электронах.

Introduction

Серийный Фемтосекундный кристаллографии (SFX) является структурной биологии техника, которая использует уникальные свойства свободных электронах рентгеновских лазеров (XFEL) для определения структуры комнатной температуре от тысячи микрометра размера кристаллов при опережающего большую часть излучения ущерб «дифракционный до разрушения» принцип1,2,3.

В времени решены расширение SFX (TR-SFX) фемтосекундных импульсов от XFEL используются для изучения структурных изменений в белки4,5. Протеин интереса активируется с оптического излучения (или другого действия триггера) накануне расстрела XFEL в установки насоса зонд. Точно управляя задержку между насоса и датчика импульсов, целевого белка могут быть захвачены в разных государствах. Молекулярные фильмы структурных изменений за одиннадцать порядков в время продемонстрировать мощь новых источников XFEL для изучения динамики нескольких белка цели6,,78,9, 10,11,12,13. Главным образом метод присоединяется к динамической спектроскопические и статические структурные методы в одну, обеспечивая мельком динамики белков в вблизи атомных резолюции.

Простые системы для TR-SFX может содержать эндогенного триггера активации с фото чувствительных компонентов, как сетчатки в бактериородопсин (bR)9,10, хромофоры фотосистемы II12,13, фотоактивного желтый белка (Рур)6,7 обратимо фотопереключаемых флуоресцентный белок11, или окиси углерода photolyzable в миоглобина8. Захватывающие вариации техника все еще в развитии полагаться на смеси и внедрить схемы14,15 для изучения ферментативных реакций или электрического поля используется, чтобы вызвать структурные изменения16. Учитывая, что XFEL источники были доступны лишь на несколько лет и экстраполяции прошлых успехов в будущем, метод показывает потенциал как реальная игра чейнджер в отношении нашего понимания того, как функция белков.

Поскольку биологические образцы уничтожаются путем одного контакта с высокой мощности XFEL пульс, необходимы новые подходы к кристаллография протеина. Среди этих процедур способность расти большое количество единообразных микрокристаллов необходимо развитых17,18,19. Чтобы включить сбор данных на XFEL, эти кристаллы должны доставлено, отбрасываются и затем вновь для каждого импульса XFEL. Учитывая, что XFELs огонь полезная импульсов на 10-120 Гц, поставки образца должны быть быстрой, стабильной и надежной, сохраняя также кристаллы нетронутыми и ограничения потребления. Среди наиболее успешных решений — инжектор микро экструзии высокой вязкости, который обеспечивает непрестанно потокового столбца комнатной температуре кристалл Ладена липидный кубической фазы (LCP) через импульсного рентгеновского луча20. Случайным образом ориентированных кристаллах, внедренной в поток LCP, которые перехватываются XFEL импульсов точечных рентгеновских лучей на детектор, где записывается дифракционный рисунок. LCP был естественным выбором для доставки средних образца, как часто используется как средство роста для мембранных белков кристаллы17,21,22,23, еще других высоковязких перевозчик СМИ 24,25,26,27,28,,2930 и31 растворимые белки также были использованы в инжектор. Во время определения структуры мембранных белков13,32 G белка-рецепторы (GPCR)33,34, в том числе успешно SFX с высокой вязкостью инжектор 35,,3637, с качеством данных, достаточных для родной фазирования38,39 во время как время, так и примеры эффективной. В настоящее время, эти форсунки более регулярно используются для измерения комнатной температуры в синхротрона источников28,30,40,41 , а также в ходе более технически требуя TR-SFX эксперименты в XFELs9,10,13,42.

Сопоставимых TR-SFX эксперименты проводились с использованием других типов инжектор как жидкой фазы доставки в потоке сосредоточены сопла6,7,12, однако, этот метод требует белка суммы не доступны для многих биологически интересных задач. Для определения статического структур с использованием вязких экструзии среднее потребление 0,072 мг белка на 10000 индексированных дифракционные текстуры по сравнению с 9.35 mg для Жидкоструйный насадки были зарегистрированы (то есть, около 130 раз больше образца эффективное)20. Высокая вязкость инжектор было показано, быть жизнеспособными образца доставки устройство для TR-SFX пока только жертвуя некоторые из этого образца эффективности43. В Ногли et al. (2018)10, например, образец потребления был около 1,5 мг на 10000 индексированных шаблонов, который выгодно отличается от аналогичных TR-SFX экспериментов с использованием PYP, где потребление среднего образца была значительно выше, с 74 мг белка на 10 000 индексированные моделей6. Высокая вязкость инжекторов таким образом имеют явные преимущества при ограничении количества белка доступны или когда кристаллы выращивают непосредственно в LCP.

Для TR-SFX с использованием высокой вязкости Инжекторы для получения наиболее достоверных данных несколько технических вопросов необходимо решать: скорость потока должна оставаться выше минимального критического значения; хит ставка должна поддерживаться на уровне, который не отображают медленно сбора данных (например, более чем на 5%); и образец должен быть доставлен без чрезмерных потрясений. В идеале, уже выполнены эти условия задолго до запланированного TR-SFX эксперимент, чтобы максимально эффективно использовать имеющееся время XFEL. Pricipally, замедление в потоке LCP может позволить зондирующего кристаллов, которые были активированы с более чем одной оптической лазерного импульса и результат в смешанных активных государств, или зондирования перекачиваемого материала, когда материал umpumped ожидается в пучке. Дополнительное преимущество инъекций предварительного тестирования, что время простоя во время сбора данных на XFEL свернуто как время отводится для замены засоренные сопла, изменения не прессовать образцы, и другие задачи обслуживания уменьшается.

Здесь мы представляем способ оптимизировать поставки образца для TR-SFX сбора данных с высокой вязкостью микро экструзии инжектор. Для простоты описанных методов не полагайтесь на доступ к источнику рентген, хотя работа Синхротронное излучение29 представит дополнительную информацию на ожидаемые хит ставки и кристалл дифракции. Наши протоколы были разработаны для оптимизации эксперименты для захвата сетчатки изомеризации в Протон насос бактериородопсин10 и осуществляется в два этапа, начиная с подготовки образцов кристалл для экструзии, следуют контроля экструзии с помощью высокоскоростной камеры установки. На первом этапе кристалл Ладена LCP смешивается с дополнительные LCP, низкой перехода температуры липиды или другие добавки, чтобы убедиться, что окончательный смесь подходит для доставки в демонстрационной среде без забивания или замедления. Новый шприц трехходовой стяжку был разработан для улучшить однородность смешивания производительности и образца. Второй этап состоит из теста экструзии, записанная с помощью высокоскоростной камеры непосредственно измерить стабильность скорости экструзии. После анализа видео данных можно внести изменения протокола Подготовка образца для улучшения экспериментальных результатов. Эти процедуры могут быть адаптированы для подготовки других белков TR-SFX сбора данных, с минимальными изменениями и будет способствовать эффективному использованию ограниченных XFEL beamtime. С новой XFEL зал просто начиная44,их эксплуатации45 и передачи последовательных данных, основанных на инжектор методов сбора synchrotrons28,30,40,41 , в ближайшие несколько лет несомненно будет продолжать оказывать захватывающее новое понимание структурной динамики все более широкий спектр белковых мишеней.

Protocol

1. белки кристалл пробоподготовки Около 30 минут, прежде чем образец должен быть введен, нагрузка 50 мкл кристалл Ладена monoolein на основе LCP в 100 мкл шприца. Для инъекций при атмосферном давлении: нагрузки 10 мкл жидкий парафин в задней части второго шприца. Держа шприц вертикально, ?…

Representative Results

Высокой плотности микрокристаллов, включены в вязкой перевозчика среднего для инжектора идеальным исходным материалом для выполнения процедур, описанных здесь (рис. 3). Процедура требует около 50 мкл кристалл Ладена перевозчика для каждого приготовлен…

Discussion

TR-SFX метод с вязкой экструзии инжектор оказалась жизнеспособной техники для исследования структурной динамики бактериородопсин9,10 и фотосистемы II13 и теперь, похоже, готов для изучения белков, вождение другие биологические процессы фото как …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем Гебхард Шертлера, Рафаэль Абела и Крис Milne для поддержки использования высокой вязкости инжекторов в PSI. Ричард Neutze и его команда признаны для обсуждения времени решены Кристаллография и поставки образца с помощью форсунок высокой вязкости. Для финансовой поддержки, мы признаем, Швейцарский Национальный научный фонд для грантов 31003A_141235, 31003A_159558 (для и.с.) и PZ00P3_174169 (для п.н.). Этот проект получил финансирование от Европейского союза Horizon 2020 исследований и инновационной программы под Грант Мари-Склодовская-Кюри соглашение № 701646.

Materials

Mosquito LCP Syringe Coupling TTP labtech store 3072-01050
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl Hamilton HA-81065
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl Hamilton HA-81265
Monoolein Nu-Chek Prep, Inc. M-239
7.9 MAG Avanti Polar Lipids Inc. 850534O
50% w/v PEG 2000 Molecular Dimensions MD2-250-7
Paraffin (liquid) Sigma-Aldrich 1.07162
High speed camera Photron Photron Mini AX
High magnification lens Navitar 12X Zoom Lens System
Three axis stage ThorLabs PT3/M
Fiber light Thorlabs OSL2
Fused silica fiber Molex/Polymicro TSP-505375
Lite touch ferrule IDEX LT-100
ASU high viscosity injector Arizona State University Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pump Shimadzu LC-20AD
Electronic gas regulator Proportion Air GP1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  2. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
  5. Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718 (2015).
  6. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  7. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
  8. Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
  9. Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  10. Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), (2018).
  11. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
  12. Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
  13. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  14. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  15. Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , 1364-1366 (2014).
  16. Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
  17. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  18. Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
  19. Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
  20. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309 (2014).
  21. Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
  22. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  23. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
  24. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
  25. Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703 (2017).
  26. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
  27. Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484 (2016).
  28. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  29. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
  30. Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
  31. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
  32. Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. “Hit and run” serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621 (2014).
  33. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  34. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  35. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
  36. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  37. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
  38. Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292 (2016).
  39. Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
  40. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  41. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
  42. Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585 (2017).
  43. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
  44. Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602 (2017).
  45. Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
  46. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
  47. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
  48. James, D. . Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
  49. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  50. Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).

Tags

High Viscosity ExtrusionMicrocrystalsTime-resolved Serial Femtosecond CrystallographyX-ray LasersLCPMonooleinMAG 7.9Liquid ParaffinSyringeCubic PhaseExtrusion TestingHPLC Pump

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
James, D., Weinert, T., Skopintsev, P., Furrer, A., Gashi, D., Tanaka, T., Nango, E., Nogly, P., Standfuss, J. Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers. J. Vis. Exp. (144), e59087, doi:10.3791/59087 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image