Att förbättra hög viskositet extrudering av Mikrokristaller för tid-löst seriell femtosekund Crystallography på röntgen lasrar

Summary

Framgången för en tid-löst seriell femtosekund kristallografi experiment är beroende av effektiva prov leverans. Här beskriver vi protokoll för att optimera extrudering av bacteriorhodopsin microcrystals från en hög viskositet mikro-extrudering injektor. Metodiken bygger på provet homogenisering med en roman trevägs koppling och visualisering med en höghastighetskamera.

Abstract

High-viscosity mikro-extrudering spridare har dramatiskt minskat prov förbrukning i seriell femtosekund kristallografiska experiment (SFX) på röntgen fri elektron lasrar (XFELs). En serie experiment med hjälp av ljus-driven proton pump bacteriorhodopsin har ytterligare etablerat dessa spridare som föredra att leverera kristaller för tid-löst seriell femtosekund crystallography (TR-SFX) att lösa strukturella förändringar av proteiner efter ljusaktivering. För att få flera strukturella ögonblicksbilder av hög kvalitet, är det viktigt att samla in stora mängder data och säkerställa clearance av kristaller mellan varje pump laserpuls. Här beskriver vi i detalj hur vi optimerat extrudering av bacteriorhodopsin microcrystals för våra senaste TR-SFX experiment på Linac koherent ljus källa (LCLS). Målet med metoden är att optimera extrudering för en stabil och kontinuerlig flöde samtidigt som en hög täthet av kristaller för att öka hastigheten på vilka data som kan samlas i en TR-SFX experimentera. Vi uppnår detta mål genom att förbereda lipidic cubic fas med en homogen fördelning av kristaller med en roman trevägs spruta kopplingsanordning följt genom att justera provets sammansättning baserat på mätningar av extrudering stabilitet med ett höghastighetståg kameran setup. Metoden kan anpassas för att optimera flödet av andra microcrystals. Installationen kommer att vara tillgängliga för användare av den nya schweiziska fri elektron Laser-anläggningen.

Introduction

Seriell femtosekund kristallografi (SFX) är en strukturbiologi-teknik som utnyttjar de unika egenskaperna hos röntgen fri elektron lasrar (XFEL) att fastställa rumstemperatur strukturer från tusentals mikrometerstort kristaller medan outrunning de flesta av den strålning skadan ”diffraktion innan förstörelsen” principen^1,2,3.

I en tid-löst förlängning av SFX (TR-SFX) används de femtosekund pulserna från XFEL att studera strukturella förändringar i proteiner^4,5. Proteinet av intresse aktiveras med en optisk laser (eller en annan aktivitet trigger) strax före att bli skjuten av XFEL i en pump-probe setup. Genom att exakt kontrollera fördröjningen mellan pumpen och sonden pulser, kan Målproteinet fångas i olika stater. Molekylär filmer av strukturella förändringar över elva storleksordningar i tid visar kraften i de nya XFEL källorna att studera dynamiken i flera protein mål^{6,7,8,9, 10,11,12,13}. Huvudsakligen, sammanfogar metoden de dynamiska spektroskopiska och statiska strukturella teknikerna till en, som ger en glimt till protein dynamics på nära atomär upplösning.

Enkla system för TR-SFX kan innehålla en endogen utlösa aktivering med en foto-känslig komponent som retinal bacteriorhodopsin (bR)^9,10, chromophores i fotosystem II^12,13, fotoaktiva gul protein (PYP)^6,7 reversibelt photoswitchable fluorescerande protein¹¹eller en photolyzable kolmonoxid i myoglobin⁸. Spännande varianter av tekniken fortfarande under utveckling beroende mix och injicera system^14,15 för att studera enzymatiska reaktioner eller ett elektriskt fält används för att framkalla strukturella förändringar¹⁶. Med tanke på att XFEL källor har bara funnits i några år och extrapolera tidigare framgångar in i framtiden, metoden visar potential som en riktig spel-växlare med avseende på vår förståelse av hur proteiner fungerar.

Eftersom biologiska prover förstörs av en enstaka exponering för en hög effekt XFEL puls, krävdes nya strategier för röntgenkristallografi. Bland dessa förfaranden, möjlighet att odla stora mängder enhetliga microcrystals behövde vara utvecklade^17,18,19. För att aktivera datainsamling på en XFEL, måste dessa kristaller levereras, kasseras, och sedan förnyas för varje XFEL puls. Med tanke på att XFELs eld användbara pulser på 10-120 Hz, måste prov leverans vara snabb, stabil och pålitlig, samtidigt också hålla kristallerna intakt och begränsa konsumtion. Bland de mest framgångsrika lösningarna är en hög viskositet mikro-extrudering injektor, som levererar ett musikutbud streaming kolumn i rumstemperatur crystal-lastad lipidic cubic fas (LCP) över de pulsade X-ray balk²⁰. Slumpmässigt orienterade kristaller, inbäddade i LCP-bäcken, som avlyssnas av XFEL pulser scatter röntgen på en detektor där en diffraktionsmönster registreras. LCP var ett naturligt val för ett prov leverans medium som det används ofta som ett odlingsmedium för membran protein kristaller^17,21,22,23, ännu andra hög viskositet datamedier ^{24,25,26,27,28,29,30} och lösliga proteiner³¹ har också använts i injektorn. SFX med hög viskositet injektorn har varit framgångsrik under strukturbestämning av membranet proteiner^13,32 inklusive G-proteinkopplade receptorer (varandra)^{33,34, 35,36,37}, med datakvalitet tillräckligt för infödda fasa^38,39 samtidigt vara både tid och prov effektivt. För närvarande är dessa spridare används mer rutinmässigt för rumstemperatur mätningar vid synkrotron källor^28,30,40,41 samt under mer tekniskt krävande TR-SFX experiment vid XFELs^9,10,13,42.

Jämförbara TR-SFX experiment har utförts med andra typer av injektor som vätskefasen leverans i ett flöde fokuserade munstycke^6,7,12, men denna metod kräver protein belopp inte tillgängliga för många biologiskt intressanta mål. För bestämning av statiska strukturer med trögflytande extrudering en genomsnittlig konsumtion av 0.072 mg protein per 10 000 indexerade diffraktionsmönster jämfört med 9,35 mg för flytande jet har munstycken rapporterats (dvs ca 130 gånger fler prov effektiv)²⁰. Hög viskositet injektorn har visat sig vara en livskraftig prov leverans enhet för TR-SFX medan endast offra några av detta prov effektiviteten⁴³. I Nogly et al. (2018)¹⁰, till exempel prov konsumtion var ca 1,5 mg per 10 000 indexerade mönster, vilket positivt kan jämföras med liknande TR-SFX experiment med den PYP där genomsnittsprov konsumtion var mycket högre med 74 mg protein per 10 000 indexerade mönster⁶. Hög viskositet spridare alltså klara fördelar när mängden protein tillgängligt är begränsande eller när kristaller odlas direkt i LCP.

För TR-SFX med hög viskositet spridare ge mest pålitliga data flera tekniska problem behöver åtgärdas: flöde hastighet måste förbli över ett minsta kritiska värde; säljfrekvens bör behållas på en nivå som inte återger datainsamling långsam (t.ex. större än 5%); och prov har levereras utan alltför stora störningar. Helst dessa villkor uppfylls redan långt innan en schemalagd TR-SFX experiment att använda tillgänglig XFEL tid så effektivt som möjligt. Pricipally, en avmattning i LCP-dataströmmen kan sondera kristaller som aktiverades med flera optiska laserpulsen och resultatet i blandade aktiva staterna eller sondera pumpade materialet när umpumped material förväntas i balken. En ytterligare fördel med injektion pre-provande är att driftstopp under datainsamling på en XFEL minimeras som tid förpassas till ersätta tilltäppta munstycken, byta ut icke-strängpressning prover, och andra underhållsuppgifter reduceras.

Här presenterar vi en metod för att optimera prov leverans för TR-SFX datainsamling med en hög viskositet mikro-extrudering injektor. För enkelhetens skull lita de beskrivna metoderna inte på tillgång till en röntgen källa, även om arbetet på en synkrotron beamline²⁹ skulle tillhandahålla ytterligare information om förväntade slå priser och crystal diffraktion. Våra protokoll utvecklades för att optimera experiment för att fånga retinal isomerization i proton-pump bacteriorhodopsin¹⁰ och genomförs i två faser börjar med förbereda crystal prover för extrudering följt av övervakning extrudering med en höghastighetskamera setup. I fas ett blandas crystal-lastad LCP med ytterligare LCP, låg övergång temperatur lipider, eller andra tillsatser för att säkerställa den slutliga blandningen är lämplig för leverans i prov miljön utan igensättning eller sakta. En ny tre-vägs spruta coupler utvecklades för att förbättra blandning prestanda och provets homogenitet. Den andra fasen består av en extrudering test registreras av en höghastighetskamera att direkt mäta extrudering hastighet stabilitet. Efter analysen av videodata, justeringar kan göras till protokollet prov förberedelse att förbättra experimentella resultat. Dessa förfaranden kan anpassas för att förbereda andra proteiner för TR-SFX datainsamling, med minimala ändringar, och kommer att bidra till en effektiv användning av begränsade XFEL beamtime. Med nya XFEL faciliteter precis börjat sin drift^44,45 och överföring av injektor-baserade seriella datainsamlingsmetoder till synkrotroner^28,30,40,41 , de närmaste åren kommer säkert fortsätta att ge spännande nya insikter i den strukturella dynamiken i ett allt större utbud av protein mål.

Protocol

1. protein Crystal provberedning Ca 30 min innan provet är att injiceras, baserat belastning 50 µL av kristall-lastad monoolein LCP i 100 µL spruta. För injektion vid atmosfäriskt tryck: belastning 10 µL av flytande paraffin på baksidan av en andra spruta. Håll sprutan vertikalt, utvisa luftbubblor från sprutan. För injektion i vakuum miljö: last 5 µL av MAG 7,9 och 5 µL av flytande paraffin på baksidan av en andra spruta. Håll sprutan vertikalt, utvisa luftbubblor från sprutan…

Representative Results

Perfekt utgångsmaterial för de förfaranden som beskrivs här (figur 3) är höga tätheter av mikrokristaller införlivas trögflytande datamedium för injektorn. Förfarandet kräver cirka 50 µL av crystal lastade bärare för tillredningen. Dessa kan odlas direkt i LCP som med bR9,10 används här som ett exempel (figur 4), eller tillagas med kristaller odlas i konv…

Discussion

TR-SFX metoden med trögflytande extrudering injektorn har visat sig vara en livskraftig teknik för strukturdynamik studier av bacteriorhodopsin^9,10 och fotosystem II¹³ och nu verkar redo att studera proteiner som kör andra Foto biologiska processer såsom ljus-driven ion transport eller sensorisk perception^5,50. De protokoll som beskrivs ovan var utformade för att maximera fram…

Materials

Mosquito LCP Syringe Coupling	TTP labtech store	3072-01050
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl	Hamilton	HA-81065
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl	Hamilton	HA-81265
Monoolein	Nu-Chek Prep, Inc.	M-239
7.9 MAG	Avanti Polar Lipids Inc.	850534O
50% w/v PEG 2000	Molecular Dimensions	MD2-250-7
Paraffin (liquid)	Sigma-Aldrich	1.07162
High speed camera	Photron		Photron Mini AX
High magnification lens	Navitar		12X Zoom Lens System
Three axis stage	ThorLabs	PT3/M
Fiber light	Thorlabs	OSL2
Fused silica fiber	Molex/Polymicro	TSP-505375
Lite touch ferrule	IDEX	LT-100
ASU high viscosity injector	Arizona State University		Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pump	Shimadzu	LC-20AD
Electronic gas regulator	Proportion Air	GP1