Summary
Двуцепочечной РНК производится во время репликации РНК вируса могут быть признаны рецепторов признание шаблон побудить врожденный иммунный ответ. Для отрицательных смысл РНК-вирусов взаимодействие между низкоуровневых двуцепочечной ДНК и РРСС остается неясным. Мы разработали метод confocal микроскопии для визуализации Аренавирусы двуцепочечной ДНК и ПРР в отдельных клетках.
Abstract
Двуцепочечные РНК (ds) выпускается в виде репликативной промежуточных во время РНК вируса. Признание малым интерферирующим РНК, принимающих шаблон признание рецепторов (ПРРС) как ретиноевой кислоты (RIG-я) как рецепторы (RLRs) рог-I и меланома дифференциация связанные белком 5 (MDA-5) приводит к индукции врожденный иммунный ответ. Формирования и внутриклеточного распределения двуцепочечной ДНК в положительных смысле РНК вируса также характеризуется микроскопии. Многие РНК-вирусов негативные чувства, включая некоторые аренавирусов, триггер врожденный иммунный ответ во время инфекции. Однако отрицательный смысл РНК-вирусов предполагалось производить низкий уровень двуцепочечной ДНК, что препятствует исследования изображений PRR распознавания вирусной РНК. Кроме того инфекции эксперименты с высоко патогенного аренавирусов должны выполняться в высокой сдерживания биобезопасности уровня удобства (BSL-4). Взаимодействие между вирусной РНК и неродным для высоко патогенного вируса РНК практически неизвестны из-за дополнительных технических проблем, которые исследователи должны сталкиваться в зал BSL-4. Недавно была признана моноклональных антител (МАБ) (клон 9D 5), первоначально использовались для обнаружения Пан энтеровирусного специально обнаружить двуцепочечной ДНК с более высокой чувствительности, чем традиционные J2 или K1 антител анти-двуцепочечной ДНК. Здесь, используя 9D 5 антитела, мы описываем confocal микроскопии протокол, который успешно используется для визуализации малым интерферирующим РНК, вирусных белков и PRR одновременно в отдельных клетках, инфицированных Аренавирусы. Протокол также подходит для изображений исследования двуцепочечной ДНК и распределения PRR в патогенные Аренавирусы инфицированных клеток в BSL4 зал.
Introduction
Начальный шаг индукции врожденный иммунный ответ является признание принимающей двуцепочечные РНК (ds), модель распознавания рецепторов (ПРРС) как ретиноевой кислоты (RIG-я) как рецепторы (RLRs) рог-I и меланома дифференциация связанных белка 5 (MDA-5)1. Для положительных смысл РНК-вирусов двуцепочечной ДНК может обычно легко обнаружить с помощью моноклональных антител (МАБ)2анти dsRNA J2 или K1. Взаимодействие между малым интерферирующим РНК и РРСС в положительных нить РНК-вирусов, таких как Пикорнавирусы, характеризуется с помощью конфокальной микроскопии3. Однако для отрицательных смысл РНК вируса, визуализации и характеристика PRR и dsRNA взаимодействия сдерживается отсутствием чувствительных антител к двуцепочечной ДНК. РНК флуоресцентной гибридизации in situ (рыба) был применен к визуализации вирусной РНК и РРСС4. Тем не менее рыба методология требует знания РНК последовательности целевого объекта и не могут быть совместимы с PRR совместно пятнать. Недавно, 9D 5 МАБ, которая первоначально была разработана для диагностики инфекции Пан энтеровирусов, было обнаружено более чувствительны, чем J2 МАБ и может легко обнаружить двуцепочечной ДНК в отрицательной смысле РНК вирус инфекции5,6. Таким образом МАБ 9D 5 — Роман и полезным инструментом для изучения вирусной репликации и взаимодействие между ПРР и вирусной РНК для отрицательных смысл РНК вируса.
Аренавирусов представляют собой семейство одноцепочечной, отрицательные чувство РНК-вирусов, которые включают несколько человеческие патогены, например вирус Ласса (LASV), вирус Хунин (JUNV) и Мачупо вирус (MACV), которые вызывают тяжелые геморрагические лихорадки заболевания людей7. Клинические данные из тяжелых и смертельных случаев Аргентинская геморрагическая лихорадка, вызванных новый мир Аренавирусы JUNV выставку необычно высокий уровень сывороточного ИФН α8,9. Мы показали, что патогенных аренавирусов NW (JUNV и MACV), но не патогенные Аренавирусы старого света, LASV, побудить типа я интерферон (ИФН) ответ в человека моноцитарных дендритных клеток10. Кроме того, RIG-I является одним из датчиков посредничество типа I ИФН ответ в JUNV-инфицированных клеток11. Мы также обнаружили, что белок протеинкиназы R (PKR) рецептор, который традиционно известен для распознавания малым интерферирующим РНК, активируется в болезнетворные СВ Аренавирусы инфекции12. Для более глубокого понимания механизма вирус специфических ИФН ответа во время Аренавирусы инфекции, мы стремились разработать протокол к визуализировать взаимодействие между вирусной РНК и цитоплазматических РРСС.
Инфекция эксперименты с патогенных JUNV, MACV и LASV должны быть выполнены в области биобезопасности уровня 4 (BSL-4) объектов. Таким образом помимо предположительно низкий уровень двуцепочечной ДНК, образованная в Аренавирусы инфекции, выполнения требований по биобезопасности является еще одной проблемой технику при выполнении визуализации исследования для этих высоко патогенные вирусы. Используя 9D 5 антитела и Candid1 # вакцинного штамма JUNV, конфокальная микроскопия-протокол на основе описанных в настоящем докладе, который успешно используется для визуализации малым интерферирующим РНК, вирусных белков и PRR одновременно в клетках, инфицированных Аренавирусы в BSL2 лаборатории. Протокол также подходит для визуализации внутриклеточного распределения двуцепочечной ДНК и PRR во время патогенных Аренавирусы инфекции в BSL4 зал.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка A549 клеток и JUNV инфекции
- Семенной 2 x 105 человеческих легких A549 клеток эпителия на поли D-Лизин (PDL) покрытием стекла coverslips в 12-ну пластины на 24 часа до инфекции.
- Подготовить аликвоты 150 мл JUNV13 на умножение инфекции (МВД) 1.0 зубного налета, образуя блок в клетку, разбавленных в Дульбекко изменение орел СМИ среднего (DMEM) дополнены плода бычьим сывороточным (ФБС) 2% и 1% пенициллина и стрептомицина (P/S ).
- Извлеките из клеточной культуры. Добавить вирус посевным материалом на каждом хорошо содержащие coverslip и проинкубируйте 1,5 ч при 37 ° C. Встряхните пластины каждые 15 мин.
- Удалить вирус посевным материалом, добавляют 1 мл DMEM дополнена 5% FBS и 1% P/S. инкубировать пластины при 37 ° C для желаемого времени точки.
2. Фиксация и иммуноокрашивания
- Аспирационная средств массовой информации. Промывайте ячейки, добавив 1 мл фосфатный буфер (PBS) дополнены кальция и магния в каждой скважине.
- Удаление PBS. Добавить 1 мл метанола (метанола) предварительно охлажденным при-20 ° C и температуре-20 ° C или на сухой лед для 15 мин.
- Удаление метанола.
- Добавьте 1 mL PBS для каждой скважины, и мыть образцы на 4 ° C с плавное покачивание на 5 мин повторить мыть в общей сложности 4 раза.
- Мыть на coverslips в 1 мл 0,2% t-octylphenoxypolyethoxyethanol 5 минут при температуре 4 ° C, с плавное покачивание фиксированные ячейки.
- Добавьте 1 mL PBS для каждой скважины. Стирать образцы на 4 ° C за 5 мин с плавное покачивание. Повторите шаг стирки для в общей сложности 4 раза.
- Чтобы обнаружить двуцепочечной ДНК и MDA5, Проинкубируйте образцы в 200 мл первичных антител, разбавленных в 3% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Разбавьте антитела анти dsRNA 9D 5 в разведении 1:2 и разбавления антитела анти MDA-5 на 1: 250. Проинкубируйте с плавное покачивание на 4 ° C на ночь.
- Удаление первичных антител и мыть каждый хорошо с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежно покачиваясь на RT. повторить это мыть еще четыре раза.
- Добавить 200 мл вторичных антител (1:2, 000 разрежения) разводят в 3% BSA и Инкубируйте на RT 1 h.
- Удаление вторичных антител и мыть каждый хорошо с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежно покачиваясь на RT. повторить это мыть еще четыре раза.
- Для обнаружения JUNV Нуклеопротеиды (NP) и RIG-я, добавляют 200 мл конъюгированных антител, разбавленных в 3% BSA. Разбавить конъюгированных анти JUNV NP (АГ-12) на 1:1,000 и Проинкубируйте образцы для 2 ч с плавное покачивание в рт. Разбавить конъюгированных антител анти-RIG-я на 1: 500 и Инкубируйте на 4 ° C на ночь с плавное покачивание.
- Удаление конъюгированных антител и мыть каждый хорошо с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежно покачиваясь на RT. повторить это мыть еще четыре раза.
- Counterstain coverslips с DAPI (1:1, 000) для 3 мин с плавное покачивание на RT.
- Мыть coverslips 3 раза, каждый раз на 5 минут в 1 мл 0,5% т-octylphenoxypolyethoxyethanol с плавное покачивание на RT.
- Мыть дважды в 1 мл PBS для 5 мин каждый раз с плавное покачивание на RT.
- Мыть раз в 1 мл ddH2O 1 мин на RT, слегка покачиваясь.
- Coverslips крепление на стекло слайда с помощью установки средств массовой информации. Пусть лечения на ночь.
- Печать слайдов с лаком и воздух сухой за 1 ч.
- Изображение на Конфокальный микроскоп с 60 x / 1.42 числовая апертура масло погружения объектива с помощью же лазер выбросов для каждого образца.
- При анализе данных, при необходимости, вносить коррективы для яркости и контрастности с помощью же линейной регулировки для всех образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол был применен для изучения распределения и colocalization между RLRs (RIG-I и MDA-5) и малым интерферирующим РНК в клетках, инфицированных JUNV. Как показано на рис.1 и рис.2, накопление двуцепочечной ДНК увеличивается с течением времени как вирусная инфекция прогрессирует. MDA-5 (рис. 1) и Рог-(рис. 2) сигналы были найдены colocalized с точечной структуры НП и двуцепочечной ДНК.
Рисунок 1: время курс двуцепочечной ДНК и JUNV NP формирования и распределения MDA-5. JUNV-инфицированных и макет инфицированные клетки A549 фиксировали, витражи и образы согласно протоколу на 24, 36 и 48 часов пост инфекции (ХПИ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: время курс двуцепочечной ДНК и JUNV NP формирования и распределения RIG-I. JUNV-инфицированных и макет инфицированные клетки A549 фиксировали, витражи и образы согласно протоколу на 24, 36 и 48 ХПИ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для положительных смысл РНК-вирусов и вирусов dsDNA dsRNA легко обнаружены с антитела анти dsRNA J2 широко используется. Однако производить двуцепочечной ДНК на низком уровне или ниже обнаружения с помощью же антитела2считаются отрицательный смысл РНК-вирусов. Таким образом многие аспекты вирусной РНК и PRR взаимодействия во многом неясным для отрицательных смысл РНК-вирусов. Мы попытались пятно для двуцепочечной ДНК в Аренавирусы инфекции, используя антитела J2, но флуоресценции сигналы были не дифференцируема, по сравнению с макет инфекции. МАБ 9D 5, первоначально предназначенных для обнаружения Пан энтеровирусов, оказалась для двуцепочечной ДНК и более чувствительны, чем J2 антитела5. Это антитело успешно использовался для выявления вирусной РНК в течение отрицательной смысл РНК вируса, включая прототип Аренавирусы лимфоцитарный хориоменингит вирус5,6,14. Соответственно мы использовали МАБ 9D 5 совместно пятно на наличие малым интерферирующим РНК, вирусный NP и неродным для более глубокого понимания их распределения и взаимодействия в отдельных клетках при Аренавирусы инфекции.
Существует несколько методов фиксации, которые могут использоваться для сохранения структуры клеток. Фиксация с метанола действует путем осаждения белков, тогда как параформальдегида и формалином сшивки белков. Метанола является более эффективным, чем альдегиды на сохранение нуклеиновых кислот в клетки и обеспечивает низкий фон иммуноокрашивания. Метанола также удаляет липиды из клеток и таким образом permeabilizes клеточных мембран на же время15. В этом протоколе клетки фиксируются с помощью ледяной метанола. Другие методы фиксации были также попытки, включая фиксации образцов с параформальдегида 4%, формалин, параформальдегид следуют метанола и метанола, следуют параформальдегида. Однако высокий базальный уровень неспецифичный пятнать наблюдалось в макет инфицированных клеток при использовании параформальдегида или формалина. Метод оптимального фиксации является фиксация с метанола при-20 ° C на чувствительность и специфичность результатов. Перед основное антитело пятная, образец блокирование с BSA 3%, 5% BSA и 10% или 5% козьего сыворотки, за 30 мин до 1 часа был испытан, но все завершилось неспецифической фон окраски. Наилучшие результаты были достигнуты без блокировки шаг и непосредственно с помощью 3% BSA в разбавления антитела. Важнейшие шаги в минимизации фон сигналы являются PBS и t-Octylphenoxypolyethoxyethanol смывки после фиксации. В то время как коммерчески доступных 9D 5, которое антитело разбавляется vender и готовы для прямого использования, 1:2 разбавления антитела с 3% BSA также работал хорошо. В случае, что сигналов двуцепочечной ДНК является слабой антитело может использоваться без разбавления.
Этот протокол может использоваться для изучения взаимодействия между малым интерферирующим РНК и РРСС Аренавирусы инфекции. Хотя эта методика была разработана в среде BSL-2, фиксация метанола, описываемые позволяет полный инактивирование Аренавирусы. Таким образом тот же протокол может применяться для исследования изображений для высоко патогенных аренавирусов (то есть, LASV, JUNV и MACV) в объекте BSL-4. Это также можно применять этот протокол исследования на других РНК вируса. Для достижения оптимальных результатов, может потребоваться изменение протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить UTMB изображений основной зал и Максим Иванников помощи микроскопа.
Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения грант, RO1AI093445 и RO1AI129198 награждены SP, до UTMB приверженность Фонда P84373 для CH и T32 AI007526 ет.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
- Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
- Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
- Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
- Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
- Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
- Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
- Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
- Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
