Induction et notation de la maladie de graft-Versus-Host dans un modèle xénogéné de murine et quantification des cellules t humaines dans des tissus de souris utilisant PCR numérique
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour induire et marquer la maladie dans un modèle xnogeneic de greffe-contre-hôte de la maladie (xenoGVHD). xenoGVHD fournit un modèle in vivo pour étudier l’immunosuppression des lymphocytes T humains. En outre, nous décrivons comment détecter les lymphocytes T humains dans les tissus avec PCR numérique comme outil pour quantifier l’immunosuppression.
Abstract
La maladie aigue de greffe-contre-hôte (GVHD) est une limitation significative pour des patients recevant la greffe hématopoïétique de cellules souches comme thérapie pour des insuffisances hématologiques et des malignités. Le GVHD aigu se produit lorsque les lymphocytes T de donneur reconnaissent les tissus d’hôte comme un antigène étranger et montent une réponse immunitaire à l’hôte. Les traitements actuels impliquent des médicaments immunosuppresseurs toxiques qui rendent les patients sensibles à l’infection et à la récidive. Ainsi, il y a la recherche continue pour fournir un traitement aigu de GVHD qui peut effectivement cibler des cellules de T de distributeur et réduire des effets secondaires. Une grande partie de ce travail préclinique utilise le modèle murine xénogène GVHD (xenoGVHD) qui permet d’tester des thérapies immunosuppressives sur les cellules humaines plutôt que des cellules murines dans un système in vivo. Ce protocole décrit comment induire le xénoGVHD et comment aveugler et normaliser la notation clinique pour assurer des résultats cohérents. En outre, ce protocole décrit comment utiliser le PCR numérique pour détecter les lymphocytes T humains dans les tissus de souris, qui peuvent ensuite être utilisés pour quantifier l’efficacité des thérapies testées. Le modèle xenoGVHD fournit non seulement un modèle pour tester les thérapies GVHD, mais toute thérapie qui peut supprimer les lymphocytes T humains, qui pourrait ensuite être appliquée à de nombreuses maladies inflammatoires.
Introduction
La greffe de cellules souches hématopoïétiques allogéniques (HSCT) est devenue un traitement de routine pour les patients souffrant de malignités hématologiques telles que la leucémie avec un pronostic médiocre. Une complication significative de HSCT est la maladie aigue de greffe-contre-hôte (GVHD). Une étude de 2012 a rapporté que le GVHD aigu s’est développé dans 39% de patients deHSCT recevant des greffes des donateurs de frère et 59% de patients recevant des greffes des donateurs non apparentés 1. Le GVHD aigu se produit quand les lymphocytes T d’origine donneuse attaquent les organes du receveur. La seule thérapie réussie pour GVHD estle traitement avec les drogues fortement immunosuppressives 2, qui sont fortement toxiques et augmentent le risque d’infection et de répétition de tumeur. Ainsi, en dépit des améliorations qui ont été apportées dans la survie aigue de GVHD ces dernières années3,4,5, il y a toujours un besoin critique pour des thérapies améliorées de GVHD avec la toxicité minimale qui favorisent la remise à long terme.
L’objectif global des méthodes suivantes est d’induire et de marquer le GVHD xénogénique (xenoGVHD). Le modèle xenoGVHD a été développé comme un outil pour induire le GVHD aigu avec des cellules humaines plutôt que des cellules murines permettant une traduction plus directe de la recherche préclinique GVHD aux essais cliniques6. Ce modèle consiste à injecter par voie intraveineuse des cellules mononucléaires sanguines périphériques humaines (PBMC) dans des souris NOD-SCID IL-2Rnull (NSG) qui sont irradiées sublethalment. Les lymphocytes T humains injectés sont activés par les cellules de présentation d’antigènes humains (APC) présentant l’antigène murine et les lymphocytes T activés migrent vers les tissus éloignés ayant pour résultat l’inflammation systémique et finalement la mort6,7, 8 Annonces , 9 (en) , 10. Pathologie et progression de la maladie dans le modèle de xénoGVHD imitent étroitement le GVHD aigu humain. Plus précisément, les lymphocytes T humains pathogènes sont réactifs aux protéines du complexe d’histocompatibilité majeur murine (MHC), qui est similaire à l’alloréactivité des lymphocytes T dans l’homme GVHD6,9. Le principal avantage du modèle xenoGVHD sur le modèle de souris MHC-inmatch, l’autre modèle GVHD largement utilisé, est qu’il permet de tester des thérapies sur les cellules humaines plutôt que les cellules murines. Cela permet de tester des produits qui peuvent être directement traduits à la clinique sans aucune modification, car ils sont faits pour cibler les cellules humaines. Récemment, ce modèle a été utilisé pour tester un anticorps humain anti-IL-211, les cellules T de régulation thymique humaine (Tregs)12 et les cellules souches mésenchymales humaines13 comme traitements potentiels pour le GVHD aigu. Dans un contexte plus large, ce modèle peut être utilisé comme un test de suppression in vivo pour tout médicament ou type de cellule qui peut supprimer l’activité des lymphocytes T humains. Par exemple, Stockis et coll.14 ont utilisé le modèle xenoGVHD pour étudier l’effet du blocage de l’intégrine v’8 sur l’activité suppressive de Treg in vivo. Ainsi, le modèle xenoGVHD peut fournir un aperçu du mécanisme de toute thérapie ciblant les lymphocytes T dans un cadre in vivo.
Une méthode supplémentaire décrite dans ce protocole est la façon de détecter les lymphocytes T humains dans les tissus de souris à l’aide de la réaction numérique en chaîne de polymérase (dPCR). L’objectif de cette méthode est d’offrir un outil pour quantifier la migration et la prolifération des lymphocytes T dans les tissus cibles, qui mesurent l’efficacité des thérapies immunosuppressives testées dans ce modèle. dPCR est une méthode relativement nouvelle pour la quantification des acides nucléiques15. En bref, le mélange de réaction PCR est divisé en partitions qui contiennent de petits nombres de la séquence cible ou pas de cible du tout. La séquence cible est ensuite amplifiée et détectée à l’aide de colorants intercalés d’ADN ou de sondes fluorescentes spécifiques à la cible. dPCR quantifie le nombre de copies de séquence cible en fonction de la fraction des partitions positives et des statistiques de Poisson15,16. La détection des lymphocytes T avec dPCR nécessite beaucoup moins de tissu par rapport à d’autres méthodes alternatives, y compris la cytométrie du débit et l’histologie, et peut être effectuée sur des tissus congelés ou fixes. dPCR n’a pas besoin d’une courbe standard pour déterminer les numéros de copie, et les répliques techniques ne sont pas requises. Cela réduit la quantité d’ADN réactif et modèle nécessaire pour dPCR par rapport à pcR quantitatif traditionnel (qPCR)16. La partition de la réaction pcR en sous-réactions dans dPCR concentre efficacement les cibles17. Ainsi, dPCR est principalement un outil pour la détection de cibles rares dans une grande quantité d’ADN non-cible. Par exemple, dPCR est utilisé pour détecter la contamination bactérienne dans le lait18, identifier les mutations rares dans le gène récepteur d’oestrogène19, et de détecter l’ADN tumoral circulant dans le sang des patients20. Dans ce protocole, dPCR sert d’outil efficace pour détecter et quantifier les lymphocytes T humains dans les tissus des souris atteintes de xénoGVHD.
Protocol
Representative Results
Discussion
La progression de la maladie est généralement cohérente dans le modèle xénoGVHD, même avec l’injection de PBMC de différents donneurs, de sorte que plusieurs expériences peuvent être combinées. Les principales étapes requises pour maintenir cette cohérence sont la technique d’injection appropriée i.v., aveuglant et la notation cohérente. Une étude par Nervi et autres25 a démontré que comparé à l’injection intraveineuse de veine de queue, les injections rétro-orbitales de PBMC o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le laboratoire de Lane Christenson pour la fourniture de la machine PCR numérique utilisée dans ces expériences et pour le soutien technique fourni. Nous tenons également à remercier le Dr Thomas Yankee pour ses conseils et son mentorat. Ces études ont été soutenues par la Fondation de la famille Tripp.
Materials
| 1.5 mL eppendorf tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 mL serological pipet | VWR International | 89130-898 | |
| 10mL BD Vacutainers – Green capped with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 366480 | |
| 250 µL Ranin pipette tips | Rainin | 17001118 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| 50 mL conical tube | VWR International | 89039-656 | |
| 96-Well ddPCR plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Optional |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 6818 | |
| Anesthesia Chamber | World Precision Instruments | EZ-178 | Provided by animal facility |
| Anesthesia Machine | Parkland Scientific | PM1002 | Provided by animal facility |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367281 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864007 | |
| DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O | Life Technologies | 1811318 | |
| Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | 45001750 | |
| Insulin Syringe | Fisher Scientific | 329424 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | Provided by animal facility |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mouse Irradiator Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | Holds up to 11 mice |
| Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| P1000 pipetman | MidSci | A-1000 | |
| P200 pipetman | MidSci | A-200 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad | 1814040 | |
| Pipetaid Gilson Macroman | Fisher Scientific | F110756 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| qPCR plates | VWR International | 89218-292 | |
| QX200 Droplet Digital PCR System | Bio-Rad | 12001925 | Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications |
| QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| RNase and DNase-free plate seal | Thermo Scientific | 12565491 | |
| RPMI Advanced 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) | Fisher Scientific | 67522 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 21040CV | |
| Sterile reservoir | VWR International | 89094-662 | |
| Surgial Scissors | Kent Scientific | INS600393-4 | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650914-4 |
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