Isolamento e trasferimento adottivo di sale alta trattati cellule dendritiche presentanti l'antigene
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per isolare le cellule dendritiche da murine milze di ordinamento magnetico delle cellule e successivo trasferimento adottivo in topi ingenuo. Il modello delle cellule dendritiche attivate di alto-sale è stato scelto per spiegare le procedure dettagliate di trasferimento adottivo e citometria a flusso.
Abstract
Assunzione di sale dietetico in eccesso contribuisce ad infiammazione e svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di ipertensione. Precedentemente abbiamo trovato che cellule dendritiche presentanti l’antigene (DCs) possono percepire elevato sodio extracellulare che conduce alla formazione di isolevuglandin (IsoLG) e l’attivazione della NADPH ossidasi-proteina addotti. Questi IsoLG-proteina addotti reagiscono con self-proteine e promuovere una autoimmune-come stato e ipertensione. Abbiamo sviluppato e ottimizzato state-of-the-art metodi per studiare la funzione delle DC nell’ipertensione. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l’isolamento, in vitro trattamento con sodio elevato e il trasferimento adottivo di murino CD11c splenica+ cellule nei topi destinatari per studiare il loro ruolo nell’ipertensione.
Introduction
L’eccesso di sale dietetico è un importante fattore di rischio per ipertensione. 1 , 2 the American Heart Association raccomanda un massimo di 2.300 milligrammi (mg) di apporto di sodio (Na+) al giorno, tuttavia; meno del 10% della popolazione statunitense osserva questa raccomandazione. 3 , 4 riduzioni modeste nell’assunzione di Na+ abbassano la pressione sanguigna e riducono l’annuali nuovi casi di malattia coronarica e ictus negli Stati Uniti del 20%. 5 un grosso problema con il consumo di sale in eccesso è che il 50% della popolazione ipertesa esibisce sale-sensibilità, definita come un aumento di 10 mmHg della pressione arteriosa dopo caricamento Na+ o un simile calo della pressione sanguigna dopo Na+ restrizione e la diuresi. 6 sale-sensibilità si verifica nel 25% degli individui normotesi ed è un preannunciatore indipendente della morte e di eventi cardiovascolari. 7 , 8 sale-sensing meccanismi nell’ipertensione che coinvolgono il rene sono stati ben studiati; Tuttavia, gli studi recenti suggeriscono che le cellule immuni possono percepire Na+. 9 , 10
La prova recente suggerisce che i cambiamenti in extra-renale Na+ manipolazione possono causare accumulo di Na+ nell’interstizio e promuovono l’infiammazione. 11 , 12 il nostro laboratorio ed altri hanno indicato che le cellule del sistema immunitario innato e adattivo contribuiscano all’esacerbazione dell’ipertensione. 9 , 13 , 14 , Vari stimoli ipertesi 15 , tra cui l’angiotensina II, noradrenalina e macrofagi causa sale, monociti e linfociti di T per infiltrarsi il rene ed il sistema vascolare e promuovere la ritenzione di Na+ , vasocostrizione, pressione sanguigna elevazione e danno d’organo fine. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 in studi precedenti, abbiamo trovato che DCs si accumulano isolevuglandin (IsoLG)-proteina addotti in risposta a vari stimoli di ipertesi compreso ipertensione di angiotensina II e DOCA-sale. 14 IsoLGs sono altamente reattivi prodotti di perossidazione lipidica che rapidamente e in modo covalente del complesso di Lisine sulle proteine e il loro accumulo è associato con l’attivazione delle DC. Formazione in murino DCs.9 entrata Na+ in DCs è mediata con amiloride sensibile trasportatori del complesso 14 recentemente abbiamo stabilito che elevato Na+ è un potente stimolo per IsoLG-proteina. Na+ viene poi scambiato per calcio (Ca2 +) tramite lo scambiatore di Na+/ca2 + . CA2 + attiva la protein chinasi C (PKC) che attiva la NADPH ossidasi che porta maggiore superossido (O2· –) e la formazione del complesso IsoLG-proteina. 9 trasferimento adottivo di sale-esposti di ipertensione numeri primi DCs in risposta ad una dose sub-pressoria di angiotensina II. 9
Identificazione di CD11c+ DCs dai tessuti è stata precedentemente limitata a immunoistochimica e RT-PCR, e isolamento di DCs è stata limitata a cella ordinamento tramite flusso cytometry. Anche se l’ordinamento delle cellule di flusso cytometry è un metodo efficace per l’isolamento delle cellule del sistema immunitario, è costoso, richiede tempo e conduce ad un rendimento basso di cellule vitali. Di conseguenza, abbiamo ottimizzato un protocollo passo dopo passo per la digestione del tessuto, stimolazione in vitro e trasferimento adottivo di CD11c+ DCs per studiare l’ipertensione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel protocollo attuale, abbiamo ottimizzato le procedure per isolare CD11c+ DCs dalle milze di topi e passivamente trasferirli in animali per studiare il ruolo di controller di dominio nell’ipertensione indotta da sale. Questo protocollo può essere adattato per isolare e trasferire passivamente altri sottoinsiemi delle cellule immuni, compreso i macrofagi, monociti e cellule immunitarie adattive, compreso i linfociti T e B. Abbiamo ottimizzato il processo di digestione splenica per ottenere la sopravvivenza d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da American Heart Association concede POST290900 al N.R.B., 17SDG33670829 a L.X. e National Institutes of Health concedere K01HL130497 A.K.
Materials
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117324 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| CD11c MicroBeads Ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-108-338 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| FITC anti-mouse CD45 | Biolegend | 103108 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use protocol: Spleen 04.01 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Invitrogen | L34964 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACs Seperator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11835-030 |
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