Summary

Изоляции и приемных передачи высоких соли лечить антиген представляя дендритные клетки

Published: March 05, 2019
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол изолировать дендритные клетки из мышиных селезенки магнитные ячейку Сортировка и последующих приемных передачи в наивной мышей. Чтобы объяснить шаг за шагом процедуры приемных передачи и проточной цитометрии была выбрана модель высоким соли активированные дендритных клеток.

Abstract

Избыток соли рацион способствует воспаление и играет жизненно важную роль в развитии артериальной гипертензии. Ранее мы обнаружили, что антиген представляя дендритных клеток (DCs) может смысле повышенных внеклеточного натрия приводит к активации NADPH оксидаза и формирование isolevuglandin (IsoLG)-аддуктов протеин. Эти IsoLG белка аддукты реагируют с self белки и поощрения государственных аутоиммунных как и гипертонии. Мы разработали и оптимизированы-современных методов для изучения функции DC в гипертензии. Здесь, мы предоставляем подробный протокол для изоляции, в vitro лечение с повышенными натрия и приемных передачи мышиных селезеночной CD11c+ клеток в получателей мышей, чтобы изучить их роль в гипертензии.

Introduction

Избыток пищевой соли является одним из основных факторов риска гипертонии. 1 , 2 американской ассоциации сердца рекомендует более 2300 миллиграммов (мг) потребления натрия (Na+) в день, однако; менее 10% населения США отмечает эту рекомендацию. 3 , 4 скромные сокращения потребления Na+ снизить кровяное давление и уменьшить ежегодный новых случаев ишемической болезни сердца и инсульта в США на 20%. 5 основная проблема избыточного потребления поваренной соли является, что 50% из населенности гипертонической exhibits соли чувствительность, определяется как 10 мм ртутного столба, увеличение артериального давления после загрузки Na+ или же падение артериального давления после Na+ ограничения и диурез. 6 соли чувствительность также происходит в 25% нормотензивной лиц и является независимым предиктором смерти и сердечно-сосудистых событий. 7 , 8 соли зондирования механизмов с участием почечной гипертонии хорошо изучены; Однако последние исследования показывают, что иммунные клетки могут смысле Na+. 9 , 10

Последние данные свидетельствуют о том, что изменения в экстра почечной Na+ обработка может вызвать накопление Na+ в интерстиции и содействовать воспаления. 11 , 12 нашей лаборатории и другие показали, что клетки врожденная и адаптивного иммунитета способствовать обострению гипертонии. 9 , 13 , 14 , 15 различных гипертонической стимулы, включая ангиотензина II, норадреналина и соли причиной макрофагов, моноцитов и лимфоцитов T для проникновения в почках и сосудистую и поощрения удержания Na+ , сужение сосудов, кровяное давление Высота над уровнем моря и конец орган ущерб. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 в предыдущих исследований, мы обнаружили, что DCs накапливать isolevuglandin (IsoLG)-белок аддукты в ответ на различные стимулы гипертонический, включая ангиотензина II и дока соль гипертонии. 14 IsoLGs Высокореактивная продуктов перекисного окисления липидов, которые быстро и ковалентно аддукт с lysines белков и их накопление связан с активацией DC. 14 недавно мы установили, что повышенные Na+ является мощным стимулом для IsoLG белка аддукт формирования в мышиных, которую DCs.9 Na+ вступления в DCs опосредуется через Амилорид чувствительных перевозчиков. Na+ затем обменять на кальция (Ca2 +) через ЦС2 + обменник Na+. CA2 + активирует протеинкиназы C (PKC) который активирует NADPH оксидаза, ведущих к увеличению супероксида (O2· –) и IsoLG белка аддукт формирования. 9 приемных передачи соли облученных DCs воспламеняет гипертензии в ответ к югу прессорных доза ангиотензина II. 9

Выявление CD11c+ РС из тканей ограничивалась ранее иммуногистохимии и RT-PCR и изоляции РС была ограничена ячейку Сортировка по проточной цитометрии. Хотя поток цитометрии сортировки клеток является мощный метод для изоляции иммунных клеток, он является дорогостоящим, требует много времени и приводит к низкой доходности жизнеспособных клеток. Таким образом, мы оптимизировали протокол шаг за шагом ткани пищеварение, в пробирке стимуляции и приемных передачи CD11c+ DCs для изучения гипертонии.

Protocol

Университет Вандербильта институциональный уход животных и использование Комитета утвердили описываемые процедуры. Мышей размещены и заботу в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных (национальных академий пресс. Пересмотренный 2010). 1. …

Representative Results

Рисунок 1 представляет собой схематическое изображение описанные выше меры. Изолированные мышиных селезенки сортируются для CD11c+ РСУ, магнитные ячейку Сортировка и покрытием в обычной соли СМИ (NS; 150 ммоль NaCl) или высокой соли СМИ (HS; 190 ммоль NaCl) за 4…

Discussion

В текущем протоколе, мы оптимизировали процедуры изолировать CD11c+ РС из селезенки мышей и восприимчивую перенести их в наивной животных для изучения роли контроллеров домена в Солт индуцированной гипертонии. Этот протокол может быть адаптирована для изоляции и восприимчивую пер…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана американская ассоциация сердца предоставляет POST290900 N.R.B., 17SDG33670829, экспериментальная и национальных институтов здравоохранения предоставить K01HL130497 а.к.

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c Biolegend 117324
autoMACS Running Buffer  Miltenyi Biotec 130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure  Miltenyi Biotec 130-108-338
Collagenase D Roche 11088866001
DNase I Roche 10104159001
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec  130-092-575
FITC anti-mouse CD45 Biolegend 103108
GentleMACS C tube Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Invitrogen L34964
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACs Seperator  Miltenyi Biotec 130-090-976
RPMI 1640 medium  Gibco 11835-030

References

  1. Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
  2. Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).
  3. Lev-Ran, A., Porta, M. Salt and hypertension: a phylogenetic perspective. Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).
  4. Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort. The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).
  5. He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).
  6. Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance. Hypertension. 8, 127-134 (1986).
  7. Morimoto, A., et al. Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension. Lancet. 350, 1734-1737 (1997).
  8. Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans. Hypertension. 37, 429-432 (2001).
  9. Barbaro, N. R., et al. Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension. Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).
  10. Kirabo, A. A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).
  11. Machnik, A., et al. Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism. Nat Med. 15, 545-552 (2009).
  12. Kopp, C., et al. 23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients. Hypertension. 61, 635-640 (2013).
  13. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).
  14. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).
  15. McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage. Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).
  16. Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. Role of the adaptive immune system in hypertension. Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).
  17. Madhur, M. S., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55, 500-507 (2010).
  18. Harrison, D. G., et al. Inflammation, immunity, and hypertension. Hypertension. 57, 132-140 (2011).
  19. Crowley, S. D., et al. Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension. American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).
  20. Zhang, J. D., et al. A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension. Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).

Play Video

Cite This Article
Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (145), e59124, doi:10.3791/59124 (2019).

View Video