Isolasjon og adopsjon overføring av høyt saltinnhold behandlet Antigen-presentasjon dendrittiske celler

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å isolere dendrittiske celler fra murine spleens av magnetiske celle sortering og påfølgende adopsjon overføring til naiv mus. Modell av høy-salt aktivert dendrittiske celler ble valgt til å forklare de trinnvise fremgangsmåtene adoptivforeldre overføring og flowcytometri.

Abstract

Overflødig salt inntak bidrar til betennelse og spiller en viktig rolle i utviklingen av hypertensjon. Vi fant tidligere at antigen-presentasjon dendrittiske celler (DCs) kan forstand opphøyet ekstracellulære natrium fører til aktivering av NADPH oksidase og dannelsen av isolevuglandin (IsoLG)-protein addukter. Disse IsoLG-protein addukter reagerer med selv-proteiner og fremme en autoimmun-lignende tilstand og hypertensjon. Vi har utviklet og optimalisert state-of-the-art metoder for å studere DC funksjonen hypertensjon. Her gir vi en detaljert protokoll for isolering, i vitro behandling med forhøyet natrium og adopsjon overføring av murine splenic CD11c⁺ celler i mottakerens mus å studere deres rolle i hypertensjon.

Introduction

Overflødig fôr salt er en stor risikofaktor for hypertensjon. ^{1 , 2} the American Heart Association anbefaler maksimalt 2300 milligram (mg) av natrium (Na⁺) per dag. mindre enn 10% av den amerikanske befolkningen observerer denne anbefalingen. ^{3 , 4} beskjeden reduksjoner i Na⁺ inntak senke blodtrykket og redusere de årlige nye tilfellene av koronar hjertesykdom og hjerneslag i USA med 20%. ⁵ et stort problem med overflødig salt forbruk er at 50% av befolkningen Hypertensiv viser salt-følsomhet, definert som en 10 mmHg økning i blodtrykket etter Na⁺ lasting eller et lignende fall i blodtrykket etter Na⁺ begrensning og diurese. ⁶ salt følsomhet også skjer i 25% av normotensive individer, og er en uavhengig prediktor for død og hjerte hendelser. ^{7 , 8} salt-sensing mekanismer i hypertensjon med nyrene har vært godt undersøkt. men tyder nyere studier på at immunceller kan forstand Na⁺. ^{9 , 10}

Nyere bevis antyder at endringer i ekstra nyre Na⁺ håndtering kan føre til opphopning av Na⁺ i interstitium og fremme betennelse. ^{11 , 12} vårt laboratorium og andre har vist at celler av både medfødte og adaptive immunsystemet bidra til forverring av hypertensjon. ^{9 , 13 , 14 , 15} ulike Hypertensiv stimuli, inkludert angiotensin II, noradrenalin og salt årsaken makrofager, monocytter og T-lymfocytter å infiltrere nyrene og blodkar og fremme Na⁺ oppbevaring, vasokonstriksjon, blodtrykk høyde og end-orgel skade. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} i tidligere studier, fant vi at DCs samle isolevuglandin (IsoLG)-protein addukter svar på ulike Hypertensiv stimuli inkludert angiotensin II og DOCA-salt hypertensjon. ¹⁴ IsoLGs er svært reaktive produkter av lipid peroxidation som raskt og covalently adduct å lysines på proteiner og deres akkumulering er knyttet til DC aktivisering. ¹⁴ vi har nylig etablert at opphøyet Na⁺ er en potent stimulans for IsoLG-protein adduct formasjon i Trouble DCs.⁹ Na⁺ inn i DCs er formidlet gjennom amilorid følsom transportører. Na⁺ deretter utvekslet for kalsium (Ca^{2 +}) via den Na⁺/ca^{2 +} exchanger. Ca^{2 +} aktiverer protein kinase C (PKC) som aktiverer NADPH oksidase fører til økt superoxide (O₂^{· –}) og IsoLG-protein adduct formasjon. ⁹ adoptivforeldre overføring av salt-eksponerte DCs primtall hypertensjon svar på en sub eksplisitte eller dose av angiotensin II. ⁹

Identifikasjon av CD11c⁺ DCs fra vev er tidligere begrenset immunohistochemistry og RT PCR og isolering av DCs er begrenset til cellen sortering av flowcytometri. Selv om flyt cytometri celle sortering er en kraftig metode for isolering av immunceller, det er kostbar, tidkrevende, og fører til en lav avkastning på levedyktige cellers. Derfor vi har optimalisert en trinnvis protokoll for vev fordøyelsen, i vitro stimulering og adopsjon overføring av CD11c⁺ DCs å studere hypertensjon.

Protocol

Vanderbilt Universitys institusjonelle Animal Care og bruk komiteen har godkjent prosedyrene som er beskrevet her. Mus er plassert og stelt i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr (National Academies trykk. Revidert 2010). 1. isolering av Spleens fra mus Forbered 1640 RPMI: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvate, 50 µM β-mercaptoethanol og 1% penicillin/streptomycin. Euthanize 10-12 uke-gamle C57bl/6 mannlige mus ved CO2 innånding. Spray brystet og …

Representative Results

Figur 1 representerer en skjematisk av beskrevet trinnene ovenfor. Isolert murine spleens sorteres for CD11c+ DCs magnetiske celle sortering og belagt i vanlig salt media (NS, 150 mmol NaCl) eller høy salt medier (HS, 190 mmol NaCl) for 48 h. CD11c+ DCs overføres deretter adoptively av retro-orbital injeksjon til naiv mottaker mus. Ti dager senere, er mus implantert med osmotisk minipumps for lav dose angiotensin II (140 ng/kg/min) inf…

Discussion

I gjeldende protokollen, vi har optimalisert prosedyrer for å isolere CD11c⁺ DCs fra spleens av mus og adoptively overføre dem i naiv dyr å studere rollen til DCs salt-indusert hypertensjon. Denne protokollen kan tilpasses å isolere og adoptively overføre andre immun celle undergrupper inkludert makrofager, monocytter og adaptive immunceller inkludert T- og B-lymfocytter. Vi har optimalisert splenic fordøyelsen prosessen for å oppnå tilstrekkelig celle overlevelse og stabilitet for DC overflaten uttryk…

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medium	Gibco	11835-030