Préparation des échantillons pour l’analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse des microvaisseaux oculaires
Summary
Caractérisation du protéome de lits microvasculaires oculaires est essentielle pour une compréhension approfondie des nombreuses pathologies oculaires chez les humains. Cette étude démontre une méthode efficace, rapide et robuste pour l’extraction de la protéine et préparation des échantillons de petits vaisseaux sanguins qui emploient les artères ciliaires postérieures courtes porcines comme navires de modèle pour l’analyse basée sur la spectrométrie de masse protéomique.
Abstract
L’utilisation des vaisseaux sanguins oculaires isolées in vitro à déchiffrer l’état physiopathologique de le œil en utilisant des approches technologiques avancées a considérablement élargi notre compréhension de certaines maladies. Spectrométrie de masse (MS)-protéomique basée a émergé comme un outil puissant pour démêler les altérations dans les mécanismes moléculaires et les protéines de signalisation dans les lits vasculaires dans la santé et la maladie. Cependant, les étapes de préparation d’échantillon avant l’analyse de MS sont cruciales d’obtenir des résultats reproductibles et approfondie élucidation du protéome complexe. Cela est particulièrement important pour la préparation des microvaisseaux oculaires, où la quantité d’échantillon disponible pour les analyses est souvent limité et par conséquent, constitue un défi pour l’extraction de protéines optimales. Cet article s’efforce de fournir un protocole efficace, rapid et robuste pour la préparation d’un lit vasculaire oculaire d’exemplaire rétrooculaire qui emploient les artères ciliaires postérieures courtes porcins. Le traite de méthode présente des procédés d’extraction de protéine du surnageant et le culot de l’échantillon après homogénéisation, nettoyage avec dispositifs de filtre centrifuge avant unidimensionnel gel électrophorèse et peptide purification de l’échantillon étapes pour la quantification exempte d’étiquette dans un système de MS d’ionisation linéaire piège ionique-orbitrap valant electrospray-chromatographie en phase liquide. Bien que cette méthode a été développée spécifiquement pour les analyses protéomique des microvaisseaux oculaires, nous avons également fourni une preuve convaincante qu’il peut aussi être facilement utilisé pour les autres échantillons tissulaires.
Introduction
L’avancement dans le domaine de la protéomique, qui autorise intégrée et une puissance de collecte de données, a considérablement révolutionné notre compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent certaines conditions de maladie ainsi qu’en reflétant la état physiologique d’une cellule spécifique population ou tissu1,2,3,4. Protéomique s’est également avérée pour être une plate-forme importante recherche ophtalmique en raison de la sensibilité et l’analyse impartiale des différents échantillons oculaires qui facilite l’identification de marqueurs de maladies potentielles pour l’éventuel diagnostic et pronostic, comme en témoignent avec élégance par de nombreuses études au cours des dernières années, y compris certains des nôtres1,5,6,7,8,9,10. Toutefois, il est souvent difficile d’obtenir des échantillons pour analyses protéomiques pour des raisons éthiques, surtout si l’on considère le besoin de matériel de contrôle des individus en bonne santé pour les analyses comparatives fiables. En revanche, il est également difficile d’obtenir un nombre suffisant d’échantillons pour l’analyse par spectrométrie de masse optimale et fiable. C’est particulièrement crucial pour les matières biologiques de masse limitée tels que micro-vaisseaux de le œil. Un tel vaisseau sanguin majeur rétrooculaire qui joue un rôle essentiel dans la régulation du débit sanguin oculaire est la courte artère ciliaire postérieure (sPCA). Toute perturbation ou anomalies dans ce lit vasculaire peuvent entraîner de graves répercussions cliniques, ce qui peuvent conduire à la pathogenèse de plusieurs maladies mortelles vue telles que le glaucome et nonarteritic neuropathie optique ischémique antérieure (NOIANA)11 , 12. Cependant, il y a un manque d’études élucider les changements proteome dans ce lit artériel en raison les inconvénients mentionnés ci-dessus. Par conséquent, ces dernières années, le porc maison (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) a émergé comme un bon modèle animal en recherche ophtalmique en raison des forte similitudes morphologiques et phylogénétiques entre les humains et les porcs13, 14,15. Porcines échantillons oculaires sont facilement disponibles et surtout, sont une représentation plus fidèle de tissus humains.
Considérant le rôle important de ces vaisseaux sanguins dans le œil, ainsi que le manque de méthodologie adapté pour l’extraction de la protéine efficace et analyses de ces microvaisseaux, nous avons caractérisé précédemment le protéome de la sPCA porcin à l’aide d’un interne protocole qui a permis l’identification d’un nombre élevé de protéines,16. Selon cette étude, nous avons également optimisé et décrit en profondeur notre méthodologie dans cet article, qui permet l’analyse du protéome de quantités infimes d’échantillons à l’aide de la sPCA porcine comme tissu de modèle. Bien que l’objectif principal de cette étude était d’établir une méthodologie compatible MS pour les vaisseaux sanguins oculaires de masse limitée, nous avons fourni des preuves expérimentales substantielles que le flux de travail décrit peut également être largement appliqué à divers échantillons tissulaires.
Il est prévu que ce flux de travail jouera un rôle déterminant pour préparation d’échantillons compatible MS haute qualité de petites quantités de matériaux pour des analyses complètes proteome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protéome complet de profilage d’une gamme variée d’échantillons oculaires est une première étape importante et indispensable d’élucider les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation impliquées dans la santé et la maladie. Afin d’obtenir des données de haute qualité et d’assurer la reproductibilité des résultats obtenus à partir de ces analyses, les étapes de préparation d’échantillon précédent sont cruciales, comme le souligne un examen par Massinissa et Al qui a examiné en pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Manicam est pris en charge par l’université recherche financement interne (Stufe 1) de l’Université de Centre médical de l’Université Johannes Gutenberg de Mayence et une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
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