Preparación de muestras para análisis de proteómica basado en la espectrometría de masa de microvasos Ocular
Summary
Caracterización del proteoma de camas microvasculares oculares es fundamental para la profunda comprensión de muchas patologías oculares en los seres humanos. Este estudio demuestra un método efectivo, rápido y robusto para la extracción de proteína y preparación de la muestra de pequeños vasos sanguíneos con las arterias ciliares posteriores cortas porcinas como recipientes de modelo de análisis basado en la espectrometría de masas proteómica.
Abstract
El uso de vasos oculares aislados in vitro para descifrar el estado fisiopatológico del ojo utilizando enfoques tecnológicos avanzados ha ampliado enormemente nuestra comprensión de ciertas enfermedades. Espectrometría de masas (MS)-basada en proteómica se ha convertido en una poderosa herramienta para desentrañar las alteraciones en los mecanismos moleculares y proteínas de señalización de vías en los lechos vasculares en salud y enfermedad. Sin embargo, los pasos de preparación de muestra antes del análisis de MS son cruciales para obtener resultados reproducibles y profundo esclarecimiento del proteoma complejo. Esto es particularmente importante para la preparación de microvasos ocular, donde la cantidad de muestra para análisis a menudo es limitado y por lo tanto, representa un reto para la extracción de proteínas óptimo. Este artículo intenta proporcionar un protocolo eficiente, rápido y robusto para la preparación de la muestra de un lecho vascular ocular de retrobulbar ejemplar con las arterias ciliares posteriores cortas porcinas. El presente método se centra en procedimientos de extracción de proteínas del sobrenadante y pellet de la muestra tras la homogeneización, limpieza con aparatos de filtro centrífugo antes unidimensional gel electroforesis y el péptido de purificación de la muestra pasos para la cuantificación de etiqueta-libre en un sistema de cromatografía líquida-electrospray ionización lineal de trampa de iones-Orbitrap MS. Aunque este método ha sido desarrollado específicamente para análisis de Proteómica de microvasos ocular, también hemos proporcionado pruebas convincentes de que puede también ser fácilmente empleado para otras muestras de tejido.
Introduction
El avance en el campo de la proteómica, que permisos integración e insuperable potencia de colección de datos, ha revolucionado grandemente nuestra comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a ciertas condiciones de enfermedad, así como en lo que refleja la estado fisiológico de una célula específica población o tejido1,2,3,4. Proteómica también ha demostrado para ser una plataforma importante en la investigación oftalmológica debido a la sensibilidad y el análisis imparcial de diversas muestras oculares que facilitaron la identificación de posibles marcadores de enfermedad para el eventual diagnóstico y pronóstico, como demuestra elegantemente por muchos estudios en los últimos años, incluyendo algunos nuestros1,5,6,7,8,9,10. Sin embargo, a menudo es difícil obtener muestras humanas para el análisis proteómico debido a razones éticas, especialmente teniendo en cuenta la necesidad de material de control de individuos sanos para análisis comparativos confiables. Por otro lado, también es difícil obtener la cantidad suficiente de muestras para análisis de espectrometría de masa óptima y confiables. Esto es particularmente crucial para masa limitada materiales biológicos tales como los vasos de sangre del ojo. Un tal retrobulbar importante vaso sanguíneo que juega un papel fundamental en la regulación del flujo sanguíneo ocular es la arteria ciliar posterior corto (sPCA). Cualquier perturbación o anomalías en este lecho vascular pueden resultar en graves repercusiones clínicas, que pueden conducir a la patogenia de varias enfermedades peligrosas para la vista como glaucoma y no arterítica neuropatía óptica isquémica anterior (NAION)11 , 12. sin embargo, hay una falta de estudios elucidar los cambios proteoma en esta cama arterial debido a los inconvenientes antes mencionados. Por lo tanto, en los últimos años, los cerdos (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) de la casa ha surgido como un buen modelo animal en la investigación oftalmológica debido a las alta similitudes morfológicas y filogenéticas entre los seres humanos y cerdos13, 14,15. Las muestras oculares porcinas están fácilmente disponibles y lo más importante, son una representación más precisa de los tejidos humanos.
Teniendo en cuenta el importante papel de estos vasos sanguíneos en el ojo, así como la escasez de metodología atendido para análisis y extracción de proteínas eficiente de estos microvasos, anteriormente hemos caracterizado el proteoma de la sPCA porcino utilizando un interno Protocolo que dio lugar a la identificación de un gran número de proteínas16. Basado en este estudio, además hemos optimizado y descrito en profundidad la metodología en este artículo, que permite el análisis del proteoma de cantidades minuciosas de muestras usando el sPCA porcino como tejido de modelo. Aunque el objetivo principal de este estudio fue establecer una metodología compatible con MS para los vasos sanguíneos oculares masa limitada, hemos proporcionado evidencia experimental considerable que el flujo de trabajo descrito también puede ser aplicado ampliamente a diversas muestras de tejido.
Se prevé que este flujo de trabajo será instrumental para preparación de muestras de alta calidad compatible con MS de pequeñas cantidades de materiales para el análisis del proteoma completo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteoma completo de perfiles de una amplia gama de muestras oculares es un primer paso importante e indispensable para dilucidar los mecanismos moleculares y las vías de señalización implicadas en la salud y la enfermedad. Con el fin de obtener datos de alta calidad y garantizar la reproducibilidad de los resultados obtenidos de estos análisis, los pasos anteriores de preparación de muestra son cruciales, como se destacó en un informe de Mandal et que discute en profundidad los procedimientos de procesamiento de m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Manicam es apoyado por la Universidad de investigación financiamiento interno (Stufe 1) desde el centro médico de la Universidad de Johannes Gutenberg universidad Maguncia y una donación de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
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