Summary

Eksempel forberedelse til masse-massespektrometri-baserte Proteomikk analyse av okulære Microvessels

Published: February 22, 2019
doi:

Summary

Proteom karakteristikk av okulære mikrovaskulær senger er avgjørende for grundig forståelse av mange okulær patologi hos mennesker. Denne studien viser en effektiv, rask og robust metode for protein utvinning og prøve forberedelse fra små blodkar ansette svin kort bakre ciliary arteriene som modell fartøy for masse-massespektrometri-baserte Proteomikk analyser.

Abstract

Bruk av isolerte okulær blodkar i vitro å dechiffrere patofysiologiske delstaten øyet ved hjelp av avanserte teknologiske tilnærminger er betydelig utvidet vår forståelse av visse sykdommer. Massespektrometri (MS)-basert Proteomikk har dukket opp som et kraftig verktøy for å løse endringer i molekylære mekanismer og signalnettverk trasé i vaskulær senger i helse og sykdom protein. Eksempel forberedelsene før MS analyser er imidlertid avgjørende reproduserbar resultater og grundig forklaring av den komplekse proteom. Dette er spesielt viktig for utarbeidelse av okulære microvessels, der eksemplar tilgjengelig for analyser er ofte begrenset og dermed utgjør en utfordring for optimal protein utvinning. Denne artikkelen forsøker å gi en effektiv, rask og robust protokoll for eksempel forberedelse fra en eksemplarisk retrobulbar okulær vaskulær seng ansette svin kort bakre ciliary arteriene. De nåværende metoden fokuserer på protein utvinning prosedyrer fra både nedbryting og pellet på utvalget etter homogenisering prøve rengjøring med sentrifugal filter enheter før endimensjonal gel gelelektroforese og peptid rensing trinn for etikett-fri kvantifisering i en væske kromatografi-electrospray ionization-lineær ion felle-Orbitrap MS system. Selv om denne metoden har blitt utviklet spesifikt for Proteomikk analyser av okulære microvessels, har vi også gitt overbevisende bevis at det kan også lett brukes for andre vev-basert prøver.

Introduction

Fremme innen Proteomikk, integrert og uovertruffen data samling makt som tillater, revolusjonert sterkt vår forståelse av molekylære mekanismer underliggende visse sykdom forhold så vel som reflekterer den fysiologisk tilstand hos en bestemt celle befolkningen eller vev1,2,3,4. Proteomikk har også vist seg for å være en viktig plattform i ophthalmica forskning følsomhet og objektiv analyse av forskjellige okulær prøver som lettere identifikasjon av potensielle sykdom markører for eventuell diagnose og prognose, som dokumentert elegant av mange studier de siste årene, inkludert noen av oss1,5,6,7,8,9,10. Men er det ofte vanskelig å få menneskelige prøver for proteomic analyser av etiske grunner, spesielt med tanke på behovet for kontroll materiale fra friske individer for pålitelig sammenlignende analyser. På den annen side, er det også vanskelig å skaffe tilstrekkelig mengde prøver for optimal og pålitelig masse spectrometric analyser. Dette er spesielt viktig for masse-begrenset biologiske materialer som mikro-blodkar i øyet. En slik stor retrobulbar blod fartøy som spiller viktige roller i regulering av okulære blodstrøm er kort bakre ciliary arterien (sPCA). Forstyrrelsene eventuelle uregelmessigheter i denne vaskulær seng kan resultere i alvorlig klinisk konsekvenser, som kan føre til patogenesen av flere sight-truende sykdommer som grønn stær og nonarteritic fremre iskemiske fiberoptisk nevropati (NAION)11 , 12. men det er en mangel på studier Klargjørende proteom endringene i denne arteriell sengen på grunn av ovennevnte ulempene. Derfor de siste årene, hus svin (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) har dukket opp som en god dyremodell ophthalmica forskning på grunn av høy morfologiske og Fylogenetiske likhetene mellom mennesker og griser13, 14,15. Svin okulær prøvene er lett tilgjengelig og viktigst er mer nøyaktig gjengivelse av menneskelig vev.

Vurderer den viktige rollen blodkar i øyet, samt mangel på metodikk hensyn til effektiv protein utvinning og analyser fra disse microvessels, har vi tidligere preget proteom av svin sPCA med en protokoll som resulterte i identifikasjon av mange proteiner16. Basert på denne studien, har vi ytterligere optimalisert og beskrev grundig vår metode i denne artikkelen, som lar proteom analyse fra minutt mengder prøver ved svin sPCA som modell vev. Selv om Hovedformålet med denne studien var å etablere en MS-kompatibel metode for masse-begrenset okulær blodårene, har vi gitt betydelige eksperimentelle bevis at beskrevet arbeidsflyten kan også være bredt brukt til forskjellige vev-basert prøver.

Det er tenkt at denne arbeidsflyten vil være instrumentell for utarbeidelse av høy kvalitet MS-kompatible prøver fra små mengder materialer for omfattende proteomanalyser.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer dyr utvalg ble utført i streng overholdelse av foreningen for i visjon og Oftalmologi (ARVO) erklæring for bruk av dyr i Ophthalmic og visjon forskning og institusjonelle retningslinjer. Denne studien ble utført og godkjent på Institutt for Oftalmologi, Universitetet medisinske sentrum Mainz. Merk: Svin øyne synsnerven og extraocular vev anskaffet frisk fra den lokale abattoir umiddelbart evaluering. Enucleated øyne ble transportert til la…

Representative Results

Begrenset utvalg tilgjengelighet er en av de største ulempene ophthalmica forskning. Tilsvarende utvinning metoder for optimal protein avkastning fra små mengder av prøver som okulær blodkar er ofte diskuteres. Dato er det en paucity metoder rettet spesielt for protein utvinning fra retrobulbar blodkar. Derfor, som et første skritt i metoden optimalisering og som et bevis-av-prinsipp å sammenligne effekten og robusthet av flere ofte ansatt protein utvinning vaskemidler til en relati…

Discussion

Omfattende proteom profilering av en rekke ulike okulær prøver er et viktig og uunnværlig første skritt å belyse den molekylære mekanismer og signalnettverk trasé innblandet i helse og sykdom. For å oppnå høy kvalitet dataene og sikre reproduserbarhet av resultatene fra disse analysene, foregående eksempel forberedelsene er avgjørende, som fremhevet i en gjennomgang av Mandal et al. som diskuteres grundig eksempel behandling prosedyrer ansette todimensjonal gel gelelektroforese og massespektrometri strategi<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Manicam støttes av den interne University forskningsmidler (Stufe 1) fra Universitetet medisinske sentrum av Johannes Gutenberg University Mainz og stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).

Materials

A. Chemicals
1, 4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 1.11474
Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) Sigma-Aldrich 5.33005
Calcium chloride dihydrate (CaCl2  Carl Roth  5239.1 2.5 mM 
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS)  Thermo Fisher Scientific 14190169
Formic acid (CH2O2) AppliChem A0748
HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) AppliChem A1605
HPLC-grade methanol (CH3OH) Fisher Scientific M/4056/17
HPLC-grade water  AppliChem A1589
Iodoacetamide (IAA) Sigma-Aldrich I6125
Kalium chloride (KCl)   Carl Roth  6781.1 4.7 mM 
Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)  Carl Roth  3904.2 1.2 mM 
LC-MS-grade acetic acid  Carl Roth  AE69.1
Magnesium sulphate (MgSO4)    Carl Roth  261.2 1.2 mM 
NuPAGE Antioxidant Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0005
NuPAGE LDS Sample buffer  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0007 4x
NuPAGE MES SDS Running Buffer  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0002 20x
NuPAGE Sample reducing agent  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0004 10x
SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) LC5925
Sequencing grade modified trypsin Promega V5111
Sodium chloride (NaCl)  Carl Roth  9265.2 118.3 mM 
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)  Carl Roth  965.3 25 mM 
Trifluoroacetic acid (TFA,  C2HF3O2) Merck Millipore 108178
α-(D)-(+)- Glucose monohydrate  Carl Roth  6780.1 11 mM 
B. Reagents and Kits
0.5mm zirconium oxide beads  Next Advance ZROB05
1.0mm zirconium oxide beads  Next Advance ZROB10
Colloidal Blue Staining  Kit Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) LC6025 To stain 25 mini gels per kit
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0321BOX 1.0 mm, 10-well
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK Merck Millipore 71772-3 20 reactions per kit
Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) Thermo Scientific 78510
C. Tools
96-well V-bottom plates Greiner Bio-One 651180
Corning 96-well flat-bottom plates Sigma-Aldrich CLS3595-50EA
Disposable microtome blades pfm Medical 207500014
Disposable scalpels #21 pfm Medical 200130021
Dissection pins  Carl Roth PK47.1
Extra Fine Bonn Scissors  Fine Science Tools 14084-08
Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) Fisher Scientific 14-432-22
Mayo scissors, Tough cut  Fine Science Tools 14130-17
Precision tweezers  Fine Science Tools 11251-10 Type 5
Precision tweezers, straight with extra fine tips Carl Roth LH53.1 Type 5
Self-adhesive sealing films for microplates Ratiolab (vWR) RATI6018412
Standard pattern forceps  Fine Science Tools 11000-12
Student Vannas spring scissors  Fine Science Tools 91501-09
Vannas capsulotomy scissors   Geuder 19760  Straight, 77 mm
ZipTipC18 pipette tips Merck Millipore ZTC18S096
D. Equipment and devices
150 × 0.5 mm BioBasic C18 column Thermo Scientific, Rockford, USA 72105-150565
30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column  Thermo Scientific, Rockford, USA 72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices  Merck Millipore UFC500396 Pack of 96.
Analytical balance Sartorius H51
Autosampler  CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland HTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm  Next Advance NA-BB-25
Eppendorf concentrator, model 5301 Sigma-Aldrich Z368172
Eppendorf microcentrifuge, model 5424 Fisher Scientific 05-403-93 Non-refrigerated
Heraeus Primo R Centrifuge Thermo Scientific 75005440 Refrigerated
Labsonic M Ultrasonic homogenizer  Sartorius BBI-8535027
LC-MS pump, model Rheos Allegro Thermo Scientific, Rockford, USA 22080
LTQ Orbitrap XL mass spectrometer  Thermo Scientific, Bremen, Germany
Multiskan Ascent plate reader  Thermo Labsystems v2.6
Rotator with vortex  neoLab 7-0045
Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) Sartorius BBI-8535612
Ultrasonic bath, type RK 31 Bandelin 329
Xcell Surelock Mini Cell Life Technologies El0001

References

  1. Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
  2. Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
  5. Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
  6. Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
  7. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
  8. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
  9. Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
  10. Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
  11. Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
  12. Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
  13. Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
  14. Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
  15. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
  16. Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
  18. Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
  19. Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
  20. Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
  21. Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
  22. de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
  23. Cottingham, K. 1DE proves its worth… again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).

Play Video

Cite This Article
Perumal, N., Straßburger, L., Schmelter, C., Gericke, A., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Manicam, C. Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels. J. Vis. Exp. (144), e59140, doi:10.3791/59140 (2019).

View Video