全组织细胞外囊的提取
Summary
在这里, 我们提供了一个详细的方案, 以分离细胞外囊泡 (ev) 从整个组织, 包括大脑和肿瘤标本。该方法提供了一种可重复的技术, 可从固体组织中提取 ev, 以便进一步进行下游分析。
Abstract
循环和间质小膜结合囊泡 (ev) 是开发新的诊断或预后生物标志物检测的有希望的目标, 并可能成为在大量的进展的重要参与者疾病。目前的研究重点是从多种细胞和组织类型分泌的囊泡的特征, 以便更好地了解 ev 在神经退行性变、炎症和癌症等疾病的发病机制中的作用。然而, 全球一致和可重复的分离和纯化囊泡的技术仍在进行中。此外,从体内固体组织中提取 ev 的方法也很少被描述。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 从整个新鲜或冷冻组织, 包括大脑和肿瘤标本中提取感兴趣的小电动车, 以便进一步表征。我们证明了该方法在多个下游分析中的适应性, 包括电子显微镜和囊泡的免疫表型表征, 以及 ev 蛋白的定量质谱。
Introduction
小的细胞外囊泡 (ev) 包括内皮衍生的外周细胞和小膜脱落的微囊泡, 具有广泛的生物医学兴趣。小 ev 是由异质种群 50-250 nm 膜结合囊泡, 其中含有生物活性蛋白、脂质和核酸, 这些物质被共同认为在多种疾病过程中发挥着重要作用。推进的研究特别将这些囊泡与神经退行性疾病和 prion 疾病、感染过程、自身免疫性或炎症性疾病以及肿瘤生长和转移1, 2,3有关,4 个,5,6,7.,8,9,10,11,12,13. 对 ev 在疾病发病机制中的重要性的生物医学研究迅速增加, 引起了人们对开发可重复和严格的分离和纯化这些囊泡的方法的平行兴趣。
电动汽车特性的历史和当前挑战是无法完全分离小型 ev 亚群。这一挑战主要是由于我们对不同囊泡的生物发生的不同分子机制的理解有限。亚群之间的重叠大小、密度和生物货物进一步控制了这些区别。这一挑战的部分原因还包括使用截然不同的浓缩技术, 在对实验室间孤立的囊泡进行下游分析方面存在不一致之处, 并破坏了全球为照亮分类电动车种群所做的努力。
值得注意的是, 大多数 ev 特性都是通过体外收集细胞培养上清液进行的, 最近的体内研究描述了从包括血浆、尿液在内的动物或人体体液中分离囊泡的技术, 和唾液。虽然在循环中大量存在的电动车, 但它也认识到, 这些囊泡在细胞间的通信事件中起着重要作用, 并存在于细胞组织的间质中。在癌症的背景下, 间质 ev 可能是特别重要的调节肿瘤微环境的癌细胞种子和转移生长 14,15。因此, 从固体组织标本中提取囊泡的技术的发展和优化具有重要价值。这些方法将提供一种方法, 直接研究有机或肿瘤衍生的 ev 从临床标本, 包括小活检和部分或全部器官切除。
在这项研究中, 以及在我们实验室16发表的上一份报告中, 我们的目标是解决目前在 ev 浓缩方法中关注的几个主要问题: 1) 描述一种可重复的技术, 以分离和净化 ev, 达到目前的最高标准。在该领域被接受;2) 试图分离高富集于内骨源性外显体的小型 ev 亚群;3) 提供从固体组织标本中提取这些囊泡的协议, 以便进一步表征。
最近, kwal 和他的同事描述了一个相对小规模的碘沙诺密度梯度, 以更高的效率分离和纯化 ev 亚群, 比可比的蔗糖密度梯度17。在所引用的研究中, 树突状细胞衍生的 ev 在相对较轻的密度分数下捕获, 与 1.1 g/ml 的密度一致, 在被认为与本报告中存在的高比例外显体的内染色体蛋白中得到了高度丰富的。分数。根据作者的研究, 这些 “真正的” 体外蛋白包括肿瘤易感基因 101 (tsg101)、合成蛋白1、cd81、adam10、ehd4 和几种环素蛋白 17。我们后来调整了这一技术, 以成功的组织离解方法描述的佩雷斯-冈萨雷斯等人18和随后的差分离心协议, 以分离整个脑源 evs16。我们还证明了这种方法在描述 ev 蛋白的效用, 结合顺序协议的下游定量和比较质谱的水泡蛋白, 以前在我们的实验室 19描述。这项工作与希尔实验室的工作是一致的, 在那里, ev 从大脑的额叶皮层丰富了 20。
在这项研究中, 我们详细阐述了这一技术, 并扩大了最近从我们的实验室公布的协议的应用, 以分离电动车从固体肺肿瘤。据我们所知, 这是首次描述从体内肿瘤标本中丰富 evs 的方案的研究。鉴于人们对电动车作为新的诊断生物标志物的广泛兴趣及其在肿瘤形成中的作用, 这种方法可能会对越来越多的科研人员有价值。从临床角度来看, 间质 ev 具有很大的诊断价值, 特别是在组织学评价有限的标本中。我们希望这里概述的方法将为从新鲜或冷冻动物或人类手术标本中获取 ev 的可重复技术提供基础, 为今后的工作铺平道路, 以揭示这些小疾病发病机制中的重要作用小泡可能会发挥。
Protocol
Representative Results
Discussion
对于小电动车在肿瘤微环境中的作用, 以及在器官发育、成熟和功能中的作用, 已经产生了很多科学兴趣。总体而言, 这项研究为从整个大脑或肿瘤标本中提取完整的 ev 提供了优化的工作流程。虽然在这里我们简单地证明了这种技术在肺肿瘤衍生的 ev 中的适用性, 但这种方法可以很容易地适应其他固体组织的工作, 为进一步对小分泌的囊泡进行体内表征提供了机会。广泛的生物医学兴趣。虽然超出?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢理查德·诺瓦科夫斯基博士和佛罗里达州立大学实验动物资源组织恭敬地提供和照顾用于开发该协议的动物。我们感谢刘霞、拉凯什·辛格博士和佛罗里达州立大学转化科学实验室在用于下游囊泡表征的质谱研究方面提供的协助, 并感谢 fsu 生物科学成像资源设施。透射电子显微镜在本研究中的应用。最后, 我们感谢 mandip sachdeva 博士 (佛罗里达 a & m 大学) 捐赠了用于开发这种方法的肿瘤标本。这项研究得到了佛罗里达州卫生部 ed 和 ethel moore 阿尔茨海默氏症研究项目的资助, 该项目颁发给了 d. g. m. 和 j. m. (6az11), 并得到了国家卫生研究院国家癌症研究所颁发的奖项。授予 d. g. m. r01 ca204621。
Materials
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 885300-0015 | Loose-fit pestle (clearance of 0.889–0.165 mm) used. |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
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