نحن تقرير طريقة بسيطة ومرنة لإجراء تصوير لايف الفلورسنت من أوراق نبات التمويل على مدى فترة ممتدة من الوقت. ونحن نستخدم نبات نبات المعدلة وراثيا معربا عن جين مراسل فلورسنت تحت سيطرة المروجين المتعلقة بالحصانة كمثال لفهم الاستجابات المناعية مصنع الزمانية المكانية.
يتم بدء الاستجابة المناعية النباتات المرتبطة ببرمجة النسخي على نطاق الجينوم في موقع الإصابة. وهكذا، ينظم الاستجابة المناعية مكانياً وزمنياً. استخدام الجينات الفلورسنت تحت سيطرة المروج المتعلقة بالحصانة في تركيبة مع الفحص المجهري fluorescence الآلي طريقة بسيطة لفهم تنظيم الزمانية المكانية لمصنع الحصانة. خلافا لانسجة الجذر التي تم استخدامها لعدد من مختلف التجارب التصوير الفلورسنت إينترافيتال، توجد بعض الأمثلة العيش-التصوير الفلورسنت لانسجة نبات التي تواجهها صفيف عدوى الجرثومية المحمولة جوا. ولذلك، قمنا بتطوير طريقة بسيطة لتحميل أوراق النباتات نبات التمويل لتصوير خلية يعيش على مدى فترة ممتدة من الوقت. قمنا باستخدام النباتات المعدلة وراثيا نبات معربا عن جينيفوسيد بروتين فلوري الصفراء (يفب) إلى إشارة التعريب النووية (NLS) تحت سيطرة المروج للجين العلامة المتعلقة بالدفاع، ( 1 باثوجينيسيسريلاتيد PR1). نحن تسللت إلى ورقة المحورة وراثيا مع Pseudomonas syringae الكهروضوئية. الطماطم DC3000 سلالة (Pst_a2) (avrRpt2) وإجراء تصوير الوقت الفاصل بين المجراة في إشارة يفب لما مجموعة 40 ح باستخدام ستيريوميكروسكوبي fluorescence الآلي. ويمكن استخدام هذا الأسلوب ليس فقط للدراسات المتعلقة بالاستجابات المناعية النبات ولكن أيضا لتحليل مختلف الأحداث الإنمائية والبيئية الاستجابات التي تحدث في أنسجة نبات.
الاستجابة المناعية النبات ينطوي برمجة النسخي دينامية ينظمها النسخ المتعددة العوامل كذلك phytohormones1. تراكم البيانات الترنسكربيتوم ويوفر فرصاً لجمع معلومات عن مصنع الجهاز المناعي: على سبيل المثال، تتالي هيكل الشبكة مما يشير إلى2. إلا أن معرفتنا بدينامية المكانية والزمانية الحصانة المصنع لا يزال محدود3،،من45.
في دراسات سابقة، التنظيم الزمانية المكانية لتعبير الجينات المتعلقة بالدفاع قد تم معظمها تحليلها باستخدام التهجين في الموقع و β-glucuronidase (غوس) مراسل مقايسة6،،من78. هذه الأساليب تسمح لنا بتصور النسخي تفعيل جينات مختلفة من الاهتمام في الموقع. بيد أن هذه الإجراءات تتطلب التثبيت الكيميائي للعينات، ومما يؤدي إلى فقدان جميع المعلومات الزمنية. الأحداث البيولوجية، مثل الحصانة، والتقدم المحرز على مر الزمن. وقد مكن استخدام لوسيفراس كمراسل القبض على ديناميات الزمانية للمروج لفائدة3. ومع ذلك، يتطلب التحليل القائم على لوسيفراس الركيزة مكلفة وحساسة للغاية للكشف عن. لزيادة فهمنا للجوانب الزمانية المكانية للاستجابة المناعية المصنع باستخدام إجراءات بسيطة، ونحن إنشاء المحورة وراثيا التمويل نبات النباتات المعبرة البروتينات الفلورية الأصفر (يفب) الجينات تنصهر فيها إشارة التعريب النووية (يفب-NLS) تحت سيطرة المروج للجينات العلامة المتعلقة بالدفاع، 1 باثوجينيسيسريلاتيد (PR1)9. كنا أوتوفلوريسسينسي الكلوروفيل، علامة على الخلايا الحية، لالتقاط عملية موت الخلايا المبرمج (PCD)، الذي غالباً ما يحدث خلال حصانة أثارت المستجيب (إيتي)، شكلاً من أشكال الحصانة النباتية الناجمة عن العدوى الممرض محددة9 , 10-رصد ديناميات الزمانية لكثافة إشارة fluorescence في الانتقال بحرية الكائنات، مثل الذين يعيشون أوراق نبات ، يتطلب صورة معقدة تجهيز البرمجيات بنيت داخليا أو المتاحة تجارياً. وبدلاً من ذلك، يحول دون نقل العينات طريقة بسيطة لحل القضية. وهنا، قمنا بتطوير طريقة مرنة وبسيطة لتصاعد يعيشون أوراق نبات نبات المحورة وراثيا للمراقبة طويلة الأجل تحت ستيريوميكروسكوبي fluorescence الآلي. الأسلوب الذي يسمح لنا بالتقاط المروج يترك الديناميات داخل المصنع سليمة نابعة من التربة خلال الأيام القليلة القادمة.
هنا، نحن تقرير طريقة بسيطة لجبل العيش ورقة نبات التعبير عن جين مراسل فلورسنت تحت سيطرة مروج للفائدة للمراقبة طويلة الأجل باستخدام ستيريوميكروسكوبي نيون الآلي. الوقت الفاصل بين التصوير مراسل الفلورية قد أنجز كثيرا في الأنسجة الجذرية؛ ومع ذلك، سوى عدد قليل من الدراسات المماثلة قد أجريت في أنسجة نبات. هذا الأكثر احتمالاً لأن يترك قادرة على التحرك بحرية في الفضاء، في حين غالباً ما دفن الجذور وإصلاحها في أجار الصلبة المتوسطة.
في هذا التقرير، ركزنا على ديناميات الزمانية المكانية للنشاط pPR1 خلال إيتي الناجمة عن Pst_a2. بالإضافة إلى تثبيت لطيف نبات المفصلة أعلاه، من المهم أن وضوح تصور ديناميات الأحداث الخلوية مثل التنشيط المروج و PCD الزمانية المكانية. إذا كان التمييز بين الخلايا تظهر النشاط pPR1 و PCD ليست حادة، تأكد من أن كافة المسافات بين الخلايا في منطقة تسلل تمتلئ تماما مع تعليق الممرض (راجع الخطوة 2، 4). هذا أمر بالغ الأهمية عند استخدام ستيريوميكروسكوبيس fluorescence واسع المجال منذ التقاط هذه المجاهر جميع إشارات يمكن اكتشافها على طول نفس الموضع العمودي للعينة. أوتوفلوريسسينسي الكلوروفيل من خلايا الباقين على قيد الحياة إلى أعلى أو أسفل الخلايا في النطاق PCD أقنعة بسهولة الخلايا الميتة العارضة لا أوتوفلوريسسينسي. وهذا أيضا صحيح بالنسبة لإشارة يفب.
ظروف الوقت الفاصل بين التصوير بحاجة إلى أن توضع بعناية من خلال عدة تجارب أولية تحت ظروف تجريبية مختلفة. معلمات لتصوير مرور الزمن يعتمد على عدة عوامل مثل نظام المجهرية والنباتات المحورة وراثيا، ومسببات الأمراض. للحصول على هذه المعلمات، نحن أولاً تحليل مختلف أوقات التعرض لكثافة إشارة يفب في ورقة تسلل في hpi 7، الذي يتزامن تقريبا مع التنشيط الأولى من pPR1. عازمة على تعرض s 5 حسب الاقتضاء لالتقاط الإشارات يفب مع ستيريوميكروسكوبي المستخدمة في هذه الدراسة. وأجرى اختبار مشابهة للتصوير أوتوفلوريسسينسي الكلوروفيل. كان مبرمجاً تعرض العينة للضوء بين فترات 3 دقيقة في الوقت الفاصل بين برنامج التصوير كتصوير ميدان مشرقة طبيعية مع الوقت أقصى قدر من التعرض. نظامنا (جدول المواد) سمح لنا أن يكون 2.5 دقيقة بالإضافة إلى يفب، وتكسر، وتصوير ميدان مشرق. وكان هذا القيد أن السبب الرئيسي لاختيار فاصل 3 دقيقة. وبعد ذلك، أكدنا أن هذا الشرط الزمني الفاصل تسبب أي ضرر واضح للعينات النباتية، وعدم حمل خارج الرحم التنشيط الخفيفة المتصلة بالإجهاد من pPR1 (الشكل 3ب، ج). وهذا أدى إلى تطوير البرنامج المستخدم في هذه الدراسة. وهكذا، تعتبر فترات 3-دقيقة لتصوير fluorescence كافية لالتقاط ديناميات pPR1 أثناء Pst_a2-بوساطة إيتي9.
المروج-مراسل ثوابت، لا سيما مع المراسل الفلورسنت تنصهر فيها NLS، استخدمت العديد من المجموعات، وهي متاحة بسهولة من مجتمع البحوث؛ وكنا في بناء نشرتها كوبو et al. 13-وهكذا، يمكن استخدام البروتوكول هو موضح هنا في دراسة علم الأحياء النباتية أي فحص أنسجة نبات، إذا تتوفر النباتات المعدلة وراثيا ملائمة. وينص البروتوكول بسيطة وسهلة لدينا فرصة عظيمة للباحثين الذين يحرصون على تحليل ديناميات الزمانية المكانية لأي حدث البيولوجية التي تحدث في أوراق، مثل الاستجابة المناعية. فمن المعقول أن لدينا طريقة استخدام قطع الشريط الحث إجهاد البدني طفيفا على العينات. ومع ذلك، يمكن أن تسيطر هذه المسألة بما في ذلك الضوابط المناسبة، الإيجابية والسلبية، مثل العلاجات وهمية، في التجارب (الشكل 3ج). يمكن تعديل الشروط التجريبية كذلك والأمثل من خلال تحليل عناصر التحكم هذه في ظروف مختلفة.
في السنوات الأخيرة، والتطور السريع لأدوات وتقنيات التصوير حفز اهتمام الباحثين في الجوانب الزمانية المكانية المعقدة للأحداث البيولوجية. في أي تحليل التصوير، تصاعد المناسبة وتحديد العينات من بين أهم القضايا. ويمكن تطبيق أسلوب المعيشة المتصاعدة أوراق نبات نمواً في هذه الدراسة البسيطة وتنوعاً والأمثل لمختلف تجارب التصوير.
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان يدعمها في اليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا [PRESTO117665 لنشره، ERATOJPMJER1502 إلى ن. ن.]، و “الجمعية اليابانية” “تعزيز العلوم” (معونة “بدء نشاط البحوث” [22880008 لنشره] والعلماء الشباب (ب) [ 23780040 إلى نشرة]). ونحن نشكر سينزاكي ألف وهاء بيتسوياكو سوزوكي Y.، Y. سوجيساوا للمساعدة التقنية الممتازة، J. باركر لتوفير سلالة Pst_a2 ، و “ديمورا ت.” لتوفير ناقلات ببجين.
Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
BM2 soil | Berger | ||
Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |