Vi rapporterar en enkel och mångsidig metod för att utföra fluorescerande live-imaging av Arabidopsis thaliana lämnar över en längre tidsperiod. Vi använder en transgena Arabidopsis växt uttrycker en fluorescerande reporter gen under kontroll av en immunitetsrelaterade arrangören som ett exempel för att få spatiotemporal förståelse för växt immunsvar.
Anläggningen immunsvaret är associerad med en genome-wide transkriptionell omprogrammering initieras på platsen för infektionen. Immunsvaret regleras således spatialt och temporalt. Användning av en fluorescerande gen under kontroll av en immunitetsrelaterade arrangören i kombination med en automatiserad fluorescensmikroskopi är ett enkelt sätt att förstå spatiotemporal förordning växt immunitet. I motsats till roten vävnader som har använts för ett antal olika intravital fluorescerande imaging experiment, finns det några fluorescerande live-imaging exempel för leaf vävnader som möter en rad luftburna mikrobiella infektioner. Därför har vi utvecklat en enkel metod för att montera bladen av Arabidopsis thaliana växter för live-cell imaging över en längre tidsperiod. Vi använde transgena Arabidopsis växter att uttrycka den gula fluorescerande protein (YFP) genefused till cellkärnelokalisering signalen (NLS) under kontroll av arrangören en försvar-relaterade markörgen, () Pathogenesis-Related 1 PR1). Vi infiltrerat ett transgena blad med Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 (avrRpt2) stam (Pst_a2) och utförs i vivo time-lapse avbildning av YFP signalen för sammanlagt 40 h med hjälp av en automatiserad fluorescens-stereomikroskop. Denna metod kan utnyttjas inte bara för studier på anläggningen immunsvar men också för analyser av olika utvecklings evenemang och miljömässiga svaren som förekommer i blad vävnader.
Anläggningen immunsvar innebär en dynamisk transkriptionell omprogrammering regleras av flera transkription faktorer samt fytohormoner1. Ansamling av transkriptom data ger möjligheter för insamling av information om växten immunsystemet: exempelvis nätverksstruktur signalering kaskad2. Vår kunskap om den rumsliga och tidsmässiga dynamiken i växten immunitet kvarstår dock fortfarande begränsade3,4,5.
I tidigare studier, har spatiotemporal reglering av försvar-relaterade genuttryck främst analyserats med hjälp av in situ hybridisering och en β-glukuronidas (GUS) reporter assay6,7,8. Dessa metoder kan vi visualisera transkriptionell aktivering av olika gener av intresse på plats. Men dessa procedurer kräver kemiska fixering av exemplar, och därmed resultera i förlust av alla temporal information. Biologiska händelser, såsom immunitet, framsteg över tiden. Användningen av luciferas som reporter har aktiverat tillfångatagandet av tidsmässiga dynamiken av arrangören av intresse3. Luciferas-baserade assay kräver dock en dyr substrat och mycket känsliga detektorer. För att öka vår förståelse av de spatiotemporal aspekterna av växten immunsvar med en enkel procedur, genererade vi transgena Arabidopsis thaliana växter uttrycker gul fluorescerande protein (YFP) genen smält till den cellkärnelokalisering signal (YFP-NLS) under kontroll av arrangören av försvar-relaterade markör genen, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9. Vi brukade klorofyll autofluorescens, en markör för levande celler, fånga processen för programmerad celldöd (PCD), som ofta sker under effektor-utlöst immunitet (ETI), en form av växten immunitet inducerad av specifika patogener infektion9 , 10. övervakning tidsmässiga dynamiken i signal fluorescensintensiteten i fritt rörliga föremål, såsom living Arabidopsis blad, kräver en komplex bildbehandling programvara antingen in-house byggt eller tillgängliga kommersiellt. Alternativt är att förebygga exemplar från att flytta en enkel metod att lösa frågan. Här utvecklade vi en mångsidig och enkel metod för montering lever bladen av en transgen Arabidopsis växt för långsiktig observation under en automatiserad fluorescens-stereomikroskop. Metoden gör det möjligt för oss att fånga arrangören dynamiken inom jord-odlade intakt växt lämnar över ett par dagar.
Vi rapporterar här, en enkel metod att montera en levande Arabidopsis blad uttrycker en fluorescerande reporter gen under kontroll av en främjare av intresset för långsiktig observation med hjälp av en automatiserad fluorescerande stereomikroskopet. Time-lapse avbildning av en fluorescerande reporter har ofta utförts i roten vävnader; dock genomförts endast ett fåtal liknande studier i leaf vävnader. Detta är sannolikt eftersom bladen kan flytta fritt i rymden, medan rötter är ofta begravda och fast i solid agarsubstrat.
I denna rapport fokuserade vi på spatiotemporal dynamiken i pPR1 aktivitet under ETI inducerad av Pst_a2. Förutom skonsam fixering av de blad som anges ovan, är det viktigt att tydligt visualisera spatiotemporal dynamiken i cellulära händelser såsom arrangören aktivering och PCD. Om skillnaden mellan celler visar pPR1 aktivitet och PCD inte är skarp, se till att alla de intercellulära utrymmena i området infiltrerade fylls helt med patogen fjädring (se steg 2,4). Detta är avgörande när du använder wide-fältet fluorescens-stereomikroskop eftersom dessa Mikroskop fånga alla detekterbara signaler längs samma vertikala position i preparatet. Klorofyll autofluorescens från överlevande celler ovanför eller under cellerna i domänen PCD maskerar enkelt döda celler uppvisar ingen autofluorescens. Detta gäller även för YFP signal.
Villkor för time-lapse avbildning måste fastställas noggrant genom flera preliminära experiment under olika experimentella förhållanden. Parametrar för time-lapse avbildning beror på flera faktorer såsom mikroskopiska system, transgena växter och patogener. För att erhålla dessa parametrar, analyserade vi först olika exponeringstider för YFP signalintensitet i infiltrerade bladet på 7 hpi, som nästan sammanfaller med den första aktiveringen av pPR1. En 5 s exponering fastställdes för att fånga YFP signal med stereomikroskopet används i denna studie. Ett liknande test utfördes för imaging klorofyll autofluorescens. Exponering av förlagan för ljus mellan 3 minuters intervall programmerades in time-lapse bildprogrammet som normala ljusa fält imaging med maximal exponeringstid. Vårt system (Tabell för material) tillät oss att ha 2,5 min förutom YFP, TXR och ljusa fält imaging. Denna begränsning var det främsta skälet för att välja ett 3 minuters intervall. Nästa, vi bekräftat att detta time-lapse tillstånd orsakade inga uppenbara skador på växtprover och inducerade inte ektopisk ljus stressrelaterade aktivering av pPR1 (figur 3B, C). Detta ledde till utvecklingen av det program som användes i denna studie. Således 3-minuters intervall för fluorescens imaging ansågs tillräcklig för att fånga pPR1 dynamics under Pst_a2-medierad ETI9.
Arrangören-reporter konstruktioner, har särskilt med fluorescerande reporter smält till Lantmäteriverket, utnyttjats av många grupper, och är lätt tillgängliga från gemenskapens forskning; Vi använde den bygga utgiven av Kubo et al. 13. således i protokollet som beskrivs här kan användas i någon växt biologi studie undersöker leaf vävnader, om lämpliga transgena växter finns. Vår enkla protokollet ger en stor möjlighet för forskare som är angelägna om att analysera spatiotemporal dynamiken i alla biologiska händelser som förekommer i blad, såsom immunsvar. Det är rimligt att vår metod att använda tejp bitar inducerar en liten fysisk stress på exemplaren. Problemet kan dock kontrolleras genom lämpliga positiva och negativa kontroller, till exempel håna behandlingar, i experimenten (figur 3C). De experimentella förhållandena kan ändras ytterligare och optimerad genom att analysera dessa kontroller under olika förhållanden.
Under de senaste åren, har snabb utveckling av imaging instrument och tekniker stimulerat intresset för forskare i de komplexa spatiotemporal aspekterna av biologiska händelser. I någon bildanalys är lämplig montering och fastställande av exemplar bland de viktigaste frågorna. Metoden enkel och mångsidig montering levande Arabidopsis lämnar utvecklats i denna studie kan tillämpas och optimerad för olika imaging experiment.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick stöd av Japan Science och Technology Agency [PRESTO117665 till S.B., ERATOJPMJER1502 till N.N.] och av Japan Society för främjande av vetenskap (Grants-in-Aid för forskning aktivitet Start-up [22880008 till S.B.] och för unga forskare (B)] 23780040 till S.B.]). Vi tackar A. Senzaki, Y. Suzuki, Y. Sugisawa och E. Betsuyaku för utmärkt teknisk assistans, J. Parker för att tillhandahålla Pst_a2 stam, och T. Demura för att tillhandahålla pBGYN vektorn.
Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
BM2 soil | Berger | ||
Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |