2 つのサンプル処理技術、高圧凍結を組み合わせることのためのプロトコルの紹介、マイクロ波試料処理は続いて集束イオンビームのビーム走査型電子顕微鏡 (FIB SEM) を使用してデータを取得するための埋め込み最小限の樹脂。マウス脛骨神経のサンプルと線虫を使用してこれを示します。
説明サンプル調製法、集束イオンビーム ビーム走査電子顕微鏡 (FIB SEM) を取得するために使用のイメージ投射様相の最も適切なコントラストで微細構造の保存の最高の品質を結合する設計されています3次元形状復元とモデリングのための連続画像のスタック。凍結 (HPF) ネイティブの構造保持に近いがその後の凍結置換頻繁に高圧に対して行わないこと十分なコントラストは、特に 3 D に必要な SEM で高品質なイメージングに必要なより大きい標本復興。したがって、このプロトコルで凍結置換後追加の対照的な手順で実施されて部屋の温度。電子レンジでは、これらの手順を実行がまた長い培養時間を必要とする従来のベンチ処理に従うことです。樹脂の最小限の量でその後埋め込みより速くより正確なターゲットと FIB SEM 内準備このプロトコルは、信頼性の高い微細構造の保全のための高圧の凍結による準備を必要とするが SEM. FIB を用いたボリューム イメージングにおける凍結置換の間に十分なコントラストを得るかサンプルの場合に特に便利最小限の樹脂埋め込みと組み合わせて、このプロトコルは高品質ボリューム データの集録に効率的なワークフローを提供します。
高圧凍結は、高品質微細構造の保存、化学固定法1を用いた従来製法よりサンプルの本来の状態を表すを取得する選択のサンプル調製法です。この低温調製法、サンプル有髄マウス組織2や線虫3モデル有機体の使用のための厳格な要件などに役立ちます。凍結置換と樹脂を埋め込み後、これらのサンプルは通常透過型電子顕微鏡 (TEM) または電子線トモグラフィー (ET) によって分析されます。場合は、大きなボリュームは、SEM による適切なイメージングがコントラストの欠如によって妨げられて多くの場合経験の大規模な高解像度 3 D 再構成の FIB SEM またはシリアル ブロック顔画像を使ってイメージ化される必要があります。FIB SEM のイメージは通常一次電子ビームからの後方散乱電子の検出によって記録されます。後方散乱電子の量は試料中の重金属の内容に比例します。したがって、プロトコルによって設計された画像のコントラストを高めるためにボリュームの追加重金属含浸。このようなメソッド化学的固定サンプルに基づいてナッツら5、シリアル ブロック顔で説明されているように四酸化オスミウム-四酸化オスミウム-thiocarbohydrazide4の組み合わせを適用および集束イオンビーム走査電子顕微鏡。フォルムアミドおよびピロガロール6または鉛アスパラギン酸7の使用を含む変更は、正常に別のイメージング技術を適用されています。
ここで提供されるプロトコルは、HPF による試料の低温作製を結合し、凍結置換後マイクロ波室温アセトンに四酸化オスミウム/thiocarbohydrazide を使用して拡張されたコントラストの処理します。我々 は有髄神経の脛骨と線虫マウスの高品質微細構造保全のため凍結高圧が必要なサンプルを表すにこれを示します。さらに、方法については、脱水、浸透後サンプルとして埋め込まれていると可能な限り小さなガレージを示した。8を埋め込むこの最小限の樹脂は興味の構造の高速ターゲット、およびイオンビームで関心領域を公開するために必要な以下の時間を含むサンプル処理に費やす時間を削減できます。さらに顕微鏡の中のサンプル準備の手順を実行した後画像とサンプルの加工は継続的に実施画像のスタックを取得します。3 D 可視化のため画像処理ソフト (技術) を使用して、データセットの部分を再構築します。
当社のワークフローでは、HPF と凍結置換による、最高の微細構造保全とサンプル ボリューム イメージングのための最も適切な対照的なを組み合わせてできる方法について説明します。これは厳密にクライオ準備を必要とする試料に対して効果的です。アプリケーションは、HPF で準備することができます小さなサンプルに制限されます。植物や微生物などの異なる性質のサンプルこのプロトコルには、適応が必要です。
最適な保全と FIB SEM を使用シリアル ブロック顔イメージングを実行するコントラストを説明するために開発されたプロトコルため、凍結置換とマイクロ波処理を用いた染色後に続いて低温固定化を適用しました。したがって、このプロトコルは、高圧の凍結には十分に小さいサンプルに制限されます。この手法で正しく固定できるサンプル サイズに一致するサンプルのキャリアのサイズによって幅 3 〜 6 mm のサイズ制限と 〜 200 μ m の厚さを設立します。坐骨神経は適切な凍結を確保するために必要な 0.2 mm のキャリアに合わせて直径が大きすぎるので、これはマウスの神経のサンプルに関連します。したがって、脛骨神経や大腿神経など他の細い神経などの小さな神経の慎重な郭清をお勧めします。髄鞘はストレッチに敏感なため、成果物を処理を避けるために新鮮な実行可能な神経の解剖時に細心の注意する必要があります。一般に、実行可能なサンプルだけを使用して、電子顕微鏡研究ください。
マイクロ波を用いた処理と最小限の樹脂埋め込み準備を高速化およびプロセスをターゲットに設計されています。常温化学固定のため変更された OTO プロトコル4を適用するマイクロ波処理が使用されます。電子レンジの均一な分布はありませんので、その温度が制御されていない適用ことができる真空はない、家庭用の電子レンジは同じ結果を得られません。小さいサンプル、; 化学物質のより良い浸透したがって、小さいサンプルで最良の結果を実現します。サンプルへの損傷を避けるためには、過熱、温度制御と最小限必要なマイクロ波電力のアプリケーションは、重要です。ベンチの処理時間が長くなることにつながる、電子レンジがない場合、マイクロ波処理手順を実行できます。SEM で対象の直接構造物サンプルの上部からできるだけ多くの樹脂を除去することが重要です。データセットを記録した後 raw データの後処理はファイルのサイズを削減し、信号対雑音比を向上させるために必要です。モダンなボリューム イメージング技術は、大量のデータを生成します。したがって、迅速かつ十分な方法でデータの処理を実行するワークステーションに十分な RAM が必要です。配置操作データセットのサイズとして、少なくとも 2 倍の RAM が必要です。
このプロトコルはc. の elegansのようにマウスと同様の神経脛骨でテストされています。Hall ら.12同じようなエンハンスメント ステップ ベンチにその凍結置換後の調製に使用線虫。ゼブラフィッシュなど他のモデル生物のプロトコルの調整が必要があるでしょうです。可能な変更の 1 つはコントラスト強化18に使用される水の添加によって凍結置換カクテルなどの構成を変更します。また、凍結置換の期間はサンプルに適応するが、急速凍結置換プロトコル19によると大幅に短縮することができます。1 つの可能性は、攪拌凍結置換プロセス20を加速するためのアプリケーションです。凍結置換後さらに変更が可能、化学物質と四酸化オスミウム21強化の繰り返されるアプリケーションなどです。電子レンジ処理中にそれぞれのサンプルの結果を最適化するためには温度、培養時間、および電源設定を変えることができます。
このプロトコルは、他の凍結置換プロトコルとシリアル ブロック面走査型電子顕微鏡、FIB SEM のイメージはサンプル ホール12のとおり各種併用そのような拡張することができますを示しています。これらのイメージングでは、拡張コントラスト、透過型電子顕微鏡には重要である必要があります。
The authors have nothing to disclose.
クラスターの卓越性とドイツ研究振興協会 (DFG) 研究センター ナノ顕微鏡と分子生理学脳 (CNMPB) は FIB SEM と a. s. (FIB SEM オペレーターの位置) を賄われています。ラボのトーマス ・ ミュラー-ライヘルトにc. の elegansサンプル.を提供ありがとうウルリッヒ ・ ワイケルトにありがとう映画に参加しています。
Instrumentation | |||
Leica HPM100 | Leica | ||
Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
EM ACE600 with gold target | Leica | ||
Crossbeam 540 | Zeiss | ||
Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
Oven | VWR | ||
Freezing | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
Forceps | FST | 11200-10 | |
Freeze substitution | |||
Acetone | science services | 10015 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
Acetone | EMS | 10015 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
Mounting | |||
SEM stubs | Science Services | E75200 | |
Aclar | Science Services | 50425-10 | |
Toothpicks | |||
filter paper | VWR | 512-3618 | |
conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
Software | |||
Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |