Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Bruke Sniper-Cas9 å minimere Off-målet effekter av CRISPR-Cas9 uten tap av på målet aktivitet Via regissert evolusjon

Published: February 26, 2019 doi: 10.3791/59202
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1ToolGen
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å optimalisere CRISPR-Cas9 for å oppnå en høyere spesifisitet uten tap av på målet aktivitet. Vi bruker en rettet utviklingen tilnærming kalt Sniper-skjermen for å finne en mutant Cas9 med de ønskede egenskapene. Sniper-Cas9 er kompatibel med avkortede single-guide RNAs og levering i et ribonucleoprotein format, kjente strategier for å oppnå høyere særegenheter.

Abstract

Utviklingen av gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR)-tilknyttede protein 9 (Cas9) i terapeutiske modaliteter krever unngå potensielt skadelige off-målet effektene. Flere metoder har blitt utviklet for å redusere slike effekter. Her presenterer vi en Escherichia coli-basert regissert utviklingen metode kalt Sniper-skjermen for å få en Cas9 variant med optimalisert spesifisitet og beholdt på målet aktivitet, kalt Sniper-Cas9. Bruker Sniper-skjermen, kan positive og negative utvalg utføres samtidig. Skjermen kan også gjentas med andre single-guide RNA (sgRNA) sekvenser å berike for ekte positiv treff. Ved hjelp av CMV-PltetO1 dual arrangøren express Cas9 varianter, kan ytelsen til grupperte biblioteket bli raskt sjekket i pattedyrceller. Metoder for å øke spesifisiteten av Sniper-Cas9 er også beskrevet. Først, bruk av avkortet sgRNAs har tidligere blitt vist å øke Cas9 spesifisitet. I motsetning til andre utviklet Cas9s beholder snikskytter-Cas9 en vill-type (WT) nivå på målet aktivitet kombinert med avkortede sgRNAs. Andre er levering av Sniper-Cas9 i ribonucleoprotein (RNP) format i stedet for en plasmider format mulig uten å påvirke sin på målet aktivitet.

Introduction

I dette papiret ønsker vi å forbedre spesifisiteten av Cas9 ved å kombinere ulike strategier. Ulike metoder for å unngå off-målet effekten av CRISPR-Cas9 har blitt utviklet. Avkortet sgRNAs kan for eksempel brukes til å oppnå høyere spesifisitet1. I tillegg kan Cas9 leveringsmåten endres fra et plasmider format til et RNP format å få høyere spesifisitet2. Bestemt aminosyre rester av Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) protein er endret etter det rasjonelle design beskrevet tidligere3,4,5. Alternativt aminosyre rester er endret på en tilfeldig måte og varianter av Cas9 med høyeste spesifisitet ble identifisert en gjær6 eller E. coli7,8 screening systemet.

Imidlertid har mange grupper rapportert at Cas9 varianter konstruert ved hjelp av utformingen til debilitate uspesifikke samspillet mellom Cas9 og underlaget utstillingen lav på målet aktiviteter7,8,-9, 10 , 11 , 12. vi utviklet en E. coli-basert system rettet evolusjon, Sniper-skjermen, skjermen tilfeldig mutagenized Cas9 varianter. En E. coli screening systemet har fordeler fremfor en gjær-system på grunn av raskere dobling tid og høyere transformasjon effektiviteten av E. coli.

Både negative og positive utvalg, basert på tre forskjellige plasmider og en genet av interesse (GOI) integrert i E. coli genomet, brukes i Sniper-skjermen. Cas9 varianter uttrykkes under CMV-PltetO1 dual-arrangøren system av en lav-kopi nummer plasmider slik at kandidatene identifisert i E. coli kan testes i pattedyrceller uten behov for subcloning. GOI er introdusert i E. coli genomet bruker Tn7 transposon system. SgRNA plasmider, som inneholder en temperatur-sensitive opprinnelsen til replikering, uttrykker en sgRNA rettet mot GOI; men samsvarer sgRNA og GOI sekvenser perfekt ikke. Et perfekt sgRNA målområde finnes på en tredje plasmider inneholder ccdB genet, som koder et dødelig produkt som forgifter gyrase. I dette systemet fjernes celler uttrykke Cas9 varianter med høy off-målet aktiviteter fordi dobbel-strand bryter (DSBs) er introdusert i webområdet ligger i genomisk DNA. På den annen side, fjernes også celler uttrykke Cas9 varianter med lav på målet aktiviteter på grunn av dødelige ccdB genuttrykk. Hvilket uttrykk varianter av Cas9 kan endres ved å endre konsentrasjonen av anhydrotetracycline (ATC), som justerer utvalg kraft.

Vi tenkte at finne målområdet sgRNA i genomic DNA i stedet for på en plasmider ville øke sensitiviteten av systemet. Fordelen med denne tilnærmingen er at det er bare én genomisk området, mens det ville være mange plasmider, hver med et målområde, innen en enkelt E. coli -cellen.

Bruke dette systemet, identifisert vi en Cas9 variant, Sniper-Cas9, som viser WT nivå på målet aktiviteter og redusert off-målet aktiviteter sammenlignet WT Cas9. Sniper-Cas9 kan oppnå enda høyere spesifisitet prosenter ved hjelp av avkortet sgRNAs eller RNP-baserte levering i stedet for plasmider basert levering.

Protocol

1. integrasjon av en menneskelig GOI i BW25141 E. coli belastningen

  1. Kloning av GOI
    1. Polymerasekjedereaksjons (PCR) forsterke en 500 bp lengde på en menneskelig GOI med ulike kandidat målområder via standardmetoder PCR primere med NotI og XhoI begrensning enzym nettsteder.
      Merk: I dette eksperimentet, GOI var menneskelig EMX1 genet.
    2. Fordøye både PCR produktet og pgrg3613 vektoren med NotI og XhoI begrensning enzymer.
    3. Gel rense ønsket fragmenter (500 bp og 12 kb).
    4. Ligate fragmenter sammen med T4 ligase. Dette blande 50 ng fordøyd pgrg36 og 6 ng av PCR sette i en reaksjon mengde 20 μL som inneholder 1 x ligase buffer og 0,5 U ligase enzym. Inkuber ved romtemperatur (RT) over natten.
    5. Den ligated plasmider forvandle DH5-α kompetent celler. Vokse den resulterende transformants på Luria kjøttkraft (LB) agar plater som inneholder ampicillin (100 μg/mL) på 32 ° C og ruge over natten. Plukk opp en koloni og vokse i LB mediet som inneholder ampicillin over natten. Isolere plasmider DNA fra den E. coli, ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig miniprep Kit. Bekreft innsetting av GOI fragmentet av Sanger sekvensering plasmider fra mini plasmider forberedelse (mini prep)13.
  2. Utarbeidelse av BW25141 -GOI
    1. Innhentet pgrg36 -GOI plasmider forvandle BW25141 E. coli belastningen. Det er viktig å bruke en BW25141 belastning for å minimere antallet av falske positive kolonier.
    2. Vokse transformert cellene i LB bufferen ved 32 ° C over natten. GOI settes inn i genomisk DNA av den BW25141 stammen (BW25141 -GOI). Fjern pgrg36 -GOI plasmider fra BW25141 -GOI belastningen ved hjelp av standard pgrg36 protokollen13. Kort, fortynne en koloni (ca. 107-brett) og vokse på en LB plate på 42 ° C over natten. Strek koloniene på LB plate og vokse dem på 42 ° C over natten.
    3. Bekrefte riktig GOI innsetting av kolonien PCR, bruker primerne foreslått i pgrg36 protokollen: 5'-GATGCTGGTGGCGAAGCTGT-3 "og 5'-GATGACGGTTTGTCACATGGA-3". Primer forsterker genomisk DNA innsetting området, og størrelsen på sluttproduktet PCR blir 904 bp pluss størrelsen på innsatsen (500 bp i dette tilfellet).
    4. Forberede electrocompetent BW25141 -GOI celler (en detaljert protokoll er beskrevet i trinnene 3.2.6–3.2.10).

2. forberedelse av Cas9 variant biblioteket

  1. Biblioteket forberedelse
    1. Transformere Cas9 vektor7 til en kommersiell E. coli mutator belastning (Tabell for materiale), og følg produsentens instruksjoner for å få en variant bibliotek (Mutator biblioteket).
    2. Utfør feilutsatte PCR hele WT Cas9 rekkefølgen Cas9 vektor, bruker en feilutsatt PCR kit (Tabell for materiale).
      Merk: Lav feilrate protokollen ble vedtatt i Sniper-Cas9 saken å unngå å forstyrre den opprinnelige funksjonen av protein.
    3. Fordøye Cas9 vektoren med passende begrensning enzymer. Gel renser PCR produktet (fra trinn 2.1.2) og fordøyd ryggraden.
      Merk: Størrelsen av SpCas9 genet er rundt 4,3 kb. XhoI og KpnI ble valgt å fordøye pBLC-SpCas9-vektoren som ble brukt i Sniper-Cas9 saken.
    4. Montere ryggraden fragmentet (fra trinn 2.1.3) og sett inn forsterket bruker feilutsatte PCR (fra trinn 2.1.3) via isotermiske i vitro rekombinasjon.
      Merk: mer enn 500 ng av ryggraden er nødvendig for å oppnå en høy konsentrasjon av biblioteket (feilutsatte PCR [EP] biblioteket). To forskjellige feilutsatte PCR kits ble brukt til å forberede EP biblioteker i Sniper-Cas9 saken (EP biblioteket I og II).
    5. Rense produktene fra samlingen (fra trinn 2.1.4) bruker en DNA rensing kit som gir lavt volum elueringsrør (Tabell for materiale). Elute med 6 μL nuclease-fritt vann (NFW) og måle konsentrasjonen av DNA.
    6. Transformere mer enn 500 ng av Cas9 biblioteket vektor (for hver av tre biblioteker) i 50 μL av electrocompetent E. coli celler (Tabell for materiale). Se electroporation protokollen i trinn 3.2.1-3.2.4. Dette biblioteket forberedelse, bruke 1 mL av SOC medium i stedet for 250 μL per 50 μL av kompetente celler.
    7. Gjøre 1: 100, 1:1, 000, og 1:10,000 fortynninger av blandingen som inneholder de gjenopprettede cellene med SOC medium. Plate utvannet cellene på 100 mm LB agar plater med chloramphenicol (12.5 μg/mL). Plate gjenværende cellene i en 245 mm2 plate. Ruge på 37 ° C over natten.
  2. Beregning av biblioteket kompleksitet
    1. Fotografere fortynning platene via en gel dokumentasjon system eller originalt. Kjøre OpenCFU programvare14 og laste opp bilder av fortynning platene. Angi gjeldende området innenfor en plate og fjerne falske kolonier.
    2. Manuelt multiplisere antall kolonier av fortynningsfaktoren for å få det opprinnelige antallet transformants. Konvertere disse tallene til logaritmisk skjemaet (grunntall 10). Beregne gjennomsnittet for å fastslå kompleksiteten i biblioteket.
    3. Da ønskede kompleksitet verdien hentes, samle alle koloniene på 245 mm firkantet plate (fra trinn 2.1.7) bruke sprederen og 20 mL LB supplert med chloramphenicol. Ikke vokse samlet koloniene og rense plasmider biblioteket bruker en kommersiell midiprep kit.
      Merk: Jo høyere biblioteket kompleksiteten, jo bedre. Når Sniper-Cas9 ble identifisert, ble et mangfold av 3 x 106 oppnådd for hvert bibliotek.

3. positive og negative screening for utvikling Cas9

  1. Målvalg og plasmider konstruksjon
    1. Velg en målet sgRNA spacer sekvens i GOI. Erstatte en eller to rester i den tilfeldige nukleotid å produsere en umake sekvens.
      Merk: Human EMX1 målområde 3 (GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA med GGG PAM) ble brukt i Sniper-Cas9 saken. Followings er sekvensene brukes: GAGTCCGAGCAGAAagAGAA, GAacCCGAGCAGAAGAAGAA, GAGTCCGAGCAGAgGAAGAA og GAGcCCGAGCAGAAGAAGAA.
    2. Sett ikke samsvarer rekkefølgen (se trinn 3.1.1) i sgRNA plasmider bruker standard oligonucleotide (oligo) kloning prosedyrer7.
    3. Inn ikke samsvarer rekkefølgen med en PAM på 3 slutten p11-lacY-wtx1 (Tabell for materiale) å konstruere ccdB plasmider bruker standard oligo kloning prosedyrer15.
  2. Utarbeidelse av Sniper-screening E. coli kompetent celler
    1. Tine BW25141 -GOI electrocompetent celler på is.
    2. Legg til 1 ng ccdB plasmider og sgRNA plasmider med dobbel uoverensstemmelser i 50 μL av tinte BW25141 -GOI celler. Forsiktig bland cellene av pipettering og flytte dem til prechilled 0,1 cm electroporation søppel.
    3. Transformere E. coli med to plasmider via electroporation. Tilsett 250 μL av SOC medium umiddelbart etter electroporation. Pipetter forsiktig løsningen å blande cellene og medium. Overføre blandingen til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
      Merk: For maksimal effektivitet, sette spenning på 1,80 kV og kjøretidsdetaljene bør være mellom 4.8 ms og 5.0 ms.
    4. Gjenopprette transformert cellene og ruge dem ved 32 ° C i 1 time med mild risting.
    5. Plate 125 μL gjenopprettede cellene i en ampicillin (50 μg/mL) / kanamycin (25 μg/mL) LB agar plate (kultur tilstand). Plate gjenværende celler på en ampicillin/kanamycin/arabinose (1.5 mg/mL) LB agar plate (ccdB-uttrykke tilstand). Ruge på 32 ° C over natten.
    6. Sjekk for fraværet av overlevende kolonier på ccdB-uttrykke tilstand plate. Samle kolonier fra kultur tilstand plate bruker sprederen og kultur i 250 mL av super optimal kjøttkraft (SOB) medium supplert med 50 μg/mL av ampicillin og 25 μg/mL av kanamycin ved 32 ° C, med milde risting.
    7. Når optisk densitet ved 600 nm (OD600) når 0,4, chill kolbe på is. Forberede prechilled deionisert vann og prechilled 10% glyserol løsning (sterilisere før bruk).
    8. Sentrifuge (på 4000 x g i 5 min på 4 ° C) cellene og kast nedbryting. Legge til 200 mL prechilled deionisert vann. Resuspend cellene med en 10 mL serologisk pipette. Gjenta dette trinnet 3 x.
    9. Vask cellene med 50 mL prechilled 10% glyserol. Sentrifuge dem som før (på 4000 x g i 5 min på 4 ° C).
    10. Forkast nedbryting og resuspend pellet i 300 μL 10% glyserol løsning. Gjør 50 μL dele og fryse dem i flytende nitrogen. Lagre cellene (Sniper-screening celler) på-80 ° C.
  3. Sniper-screening
    1. Transformere Sniper-screening cellene (fra trinn 3.2.10) med 100 ng av Cas9 variant plasmider fra hvert bibliotek (fra trinn 2.2.3.See trinn 2.1.1 og 2.1.4). Fremgangsmåten electroporation beskrevet i trinnene 3.2.1–3.2.3.
    2. Overføre 250 μL cellene til en frisk 1,5 mL microcentrifuge tube. Legge til 250 pg av ATC å gjøre en siste konsentrasjon av 10 ng/mL. Gjenopprette både ATC inneholder og ATC-fri celler (se trinn 3.2.4 for utvinning trinn).
    3. Plate 25 μL gjenopprettede ATC-fri celler i en chloramphenicol/kanamycin LB agar plate (ikke-selektivt tilstand). Legge til ATC gjenopprettede ATC inneholder cellene til å gjøre en siste konsentrasjon 100 ng/ml på en 245 mm LB plate. Umiddelbart plate cellene i en chloramphenicol/kanamycin/arabinose LB agar plate (selektiv tilstand). Ruge over natten på 32 ° C.
      Merk: Størrelse og antall LB platen bestemmes av størrelsen på mangfoldet av screening dekker. Hvis en 100 mm Petriskål med 20 mL LB, legge 2 μg av ATC.
    4. Fotografere platene. Telle antall levedyktig kolonier bruk OpenCFU programvare14. (Se trinn 2.2.1) Kontroller at antall kolonier på ikke-selektivt plate er minst 10 x større enn mangfoldet i biblioteket for å dekke alle varianter.
    5. Beregne den overlevelse frekvensen som følger.
      Overlevelse frekvens = antall kolonier på en selektiv plate / (antall kolonier på en ikke-selektivt plate x 10)
    6. Basseng koloniene som overlevde på selektiv plater fra alle tre biblioteker. Inkuber overlevende koloniene i 250 mL av LB medium supplert med 12.5 μg/mL chloramphenicol på 42 ° C over natten. Isolere vist Cas9 biblioteket DNA ved hjelp av en midiprep kit.
      Merk: Dette trinnet fjerner sgRNA plasmider.
    7. Gjenta utvelgelsesprosedyren fra trinn 3.3.1–3.3.6 til overlevelse frekvensen når et platå. Bruk 10 ng av den valgte Cas9 plasmider for transformasjon og 10 ng/mL av ATC under gjenoppretting. Opprettholde ATC konsentrasjonen på 100 ng/mL for selektiv betingelsen.
  4. Stokking og andre screening
    1. Shuffle valgte grupperte variantene ved hjelp av følgende DNA-stokking protokollen. PCR forsterke Cas9 sette i Cas9 plasmider bruker flankemanøveren primere, 150 nukleotider fra sett inn grensene. Digest 2 μg forsterket PCR-produktet med DNase jeg for 1 min på 37 ° C.
    2. Rense fragmenter 70-200 bp i lengde med 2% agarose gel geleelektroforese. PCR forsterke renset fragmenter. Bruk produktet som en mal for PCR forsterke Cas9 innsatsen med riktig primer flankert Cas9. Bruk PCR sluttproduktet for å konstruere et Cas9 bibliotek som beskrevet i trinn 2.1.4.
    3. Klargjør nye Sniper-screening celler (se kapittel 3.2) med en annen feilaktige sgRNA plasmider (se trinn 3.1.1). Gjør om utvelgelsesprosedyren (seksjoner 3.2-3.3) inntil den overlevelse rate når et platå. Bruk 10 ng av den valgte Cas9 plasmider for transformasjon og 10 ng/mL ATC under gjenoppretting. Opprettholde ATC konsentrasjonen på 10 ng/mL for selektiv betingelsen.
  5. Utvalg av utviklet Cas9 mutant plasmider
    1. Etter siste screening trinn, tilfeldig plukke hundre kolonier fra selektiv platen og kultur dem i chloramphenicol inneholder LB medium på 42 ° C over natten.
    2. Isolere plasmider bruker en miniprep fremgangsmåte og Sanger-sekvens som setter inn bruker sekvensering primere i Cas9.
    3. Velg de øverste tre vanligste variantene å teste dem i humane cellelinjer.

4. levert av Cas9 som en RNP med avkortede sgRNA

  1. Gene Målvalg bruker Cas-OFFinder
    1. Velg målområder med Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Velg hvilken PAM passer til bestemte Cas9 og målet genomet (menneskelig, mus, sebrafisk, etc.). Fyll i kategorien spørring sekvenser , velge Mismatch nummerog klikker Send -knappen.
    2. Etter noen sekunder, og på målet (med et feil antall '0') og off-målet områder vil vises. Generelt, velge off-målet nettstedene med en til tre uoverensstemmelser.
  2. Utarbeidelse av malen sgRNA
    1. Bestill crRNA og tracrRNA oligos med følgende mal sekvenser, nemlig crRNA rekkefølge: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAA-3'; tracrRNA rekkefølge: 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3 ". Fyll N20 i crRNA sekvensen med målet sekvensen fikk i trinn 4.1.2. Utforme avkortet sgRNAs, fjerne baser fra 5 til slutt å få N19, N18 eller N17 sgRNA sekvenser.
    2. Forberede PCR blandingen forsterkning av sgRNA-koding sekvensen som følger: kombinere 10 μL 5 x buffer, 0,5 μL crRNA oligo (100 pmol/μL), 0,5 μL tracrRNA oligo (100 pmol/μL), 2,5 μL dNTPs (10 mM hver), 0,5 μL DNA polymerase , og 36 μL NFW (tabell av materialer).
    3. Forsterke malen bruker følgende betingelser, nemlig for den første rødsprit: 1 min på 98 ° c. for rødsprit, annealing og utvidelse: 10 s på 98 ° C, 15 s på 54 ° C, 20 s ved 72 ° C, for 25 sykluser; for endelig utvidelse: 5 min på 72 ° C.
    4. Analysere 2 μL forsterket malen DNA (fra trinn 4.2.3) på en 2% agarose gel. Rense malen et PCR rensing kit.
      Merk: Størrelsen på malen DNA er 125 bp.
  3. Syntese av sgRNA
    1. Forberede reaksjonsblandingen sgRNA syntese som følger: kombinere 8,5 μL mal DNA (fra trinn 4.2.3), 1 μL UTP (25 mM), 1 μL CTP (25 mM), 1 μL GTP (25 mM), 1 μL ATP (25 mM), 4,2 μL MgCl2 (100 mM) , 4,5 μL T7 RNA polymerase (50 U/μL), 3 μL 10 x T7 RNA polymerase buffer, 1,2 μL pyrophosphatase (0,5 U/μL), 0,75 μL RNase hemmer (40 U/μL) og 4,2 μL NFW.
    2. Inkuber reaksjonsblandingen på 37 ° C over natten (minst 10 h). Legge til 0,5 μL DNase (2 U/μL) til reaksjonsblandingen og Inkuber ved 37 ° C i 15-30 min. rense sgRNA bruker en RNA rensing kit.
    3. For å redusere toksisitet forårsaket av en medfødt immunrespons utløst av den 5'-trifosfat på sgRNA16, fjerne 5'-trifosfat fra guide RNAs med kalv intestinal alkalisk fosfatase (CIP) som følger: behandle 10 µg av i vitro- transkribere RNA med 250 U av CIP for 3t på 37 ° C i nærvær av 100 U av RNase hemmer. Rense CIP-behandlet sgRNA bruker en RNA rensing kit.

5. Cas9 WT og snikskytter protein uttrykk og rensing

  1. Protein uttrykk i E. coli
    1. Transformere pET plasmider18 koding hans-merket WT - og Sniper-Cas9 i BL21 (DE3) E. coli belastning.
    2. Vaksinere 50 mL av LB medium som inneholder 50 μg/mL kanamycin med en frisk koloni skjuler pET-Cas9 uttrykk plasmider og riste det overnatting (200 rpm) på 37 ° C (preculture).
    3. Overfør 10 mL av natten kultur til 500 mL av fersk LB medium som inneholder 50 μg/mL kanamycin. Inkuber kulturen med skjelvende (200 rpm) ved 37 ° C i 2 timer.
    4. Overvåke OD600 til kultur når den midt Logg vekstfase (OD600 ≈ 0.6-0,7).
    5. Induserer uttrykk for WT eller Sniper Cas9 protein med isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, på en siste konsentrasjon av 0,25 nM). Inkuber kulturen ved 18 ° C over natten.
  2. Protein rensing
    1. Høste celler med sentrifugering 5000 x g i 10 min på 4 ° C.
    2. Resuspend pellet i lyseringsbuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 4 mM dithiothreitol [DTT], 5 mM benzamidine, 100 mM phenylmethylsulfonyl fluor [PMSF], pH 8) på 20 mL per gram våt vekt.
    3. Legge til PMSF, DTT og lysozyme en siste konsentrasjon av 1 mg/mL hver og ruge blandingen på is 30 min.
    4. Sonicate cellene på is. Puls gjentatte ganger for 10 s på 200-300 M med en 10 s kjøling perioden mellom hver puls, for 20 min totale tiden.
    5. Sentrifuge lysate 6000 x g i 30 min på 4 ° C.
    6. Fjerne nedbryting slik frisk. Legg 1 mL av hans-Bind agarose harpiks til 5 mL fjernet lysate og riste forsiktig i 1 h på 4 ° C.
    7. Last lysate/hans-binde Agarose harpiks blandingen til en kolonne med en avkortet bunnen stikkontakt.
    8. Fjerne bunnen hetten og samle gjennomflytsenhet kolonnen.
    9. Vask kolonnen 2 x med vaskebuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8); samle vask brøken for analyse av natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side).
    10. Elute protein 10 x med 1 mL av elueringsrør buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8), samle eksempler for SDS-side.
    11. Konsentrere seg elut WT - eller Sniper-Cas9 protein med et 100 kolonnefilter for kDa. Lagre prøvene i en løsning av 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl og 50% glyserol på-80 ° C.

6. RNP levering

  1. Hva og utarbeidelse av celler for RNP levering
    1. Opprettholde HEK293T celler i Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% antibiotika på 37 ° C med 5% CO2.
    2. Bland WT eller Sniper Cas9 protein (2 μg) med sgRNA (2 μg) og ruge i 10 min på RT gjøre RNP komplekser.
    3. Trypsinize og telle celler. Forberede 2 x 104 celler per en reaksjon. Vask cellene med fosfat-bufret saltvann (PBS) og sentrifuger. Sug opp nedbryting og resuspend pellets med electroporation buffer.
    4. Electroporate RNP komplekser inn i celler ved hjelp av følgende innstillinger, nemlig 1300 V 30 ms, og en puls. Plate cellene i en 48-vel plate fylt med 500 μL DMEM supplert med FBS og antibiotika (som beskrevet i trinn 6.1.1) rett etter electroporation. Ruge på 37 ° C med 5% CO2.
    5. Isolere genomisk DNA med en gDNA forberedelse kit, 48 timer etter transfection.

7. hva av plasmider koding Sniper-Cas9 og sgRNA

  1. Byggingen av en sgRNA plasmider
    1. Bestill frem og omvendt oligos med følgende mal sekvenser, nemlig frem: 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'; omvendt: 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3 ". Erstatt N20 med målet sekvensen fikk i trinn 4.1.2. Forkorte lsekvens til en lengde på N19, N18 eller N17 å syntetisere avkortet sgRNA.
    2. Anneal både oligos i 1 x T4 DNA ligase buffer.
    3. Fordøye den pRG2 vektoren med BsaI begrensning enzym.
    4. Gel rense fordøyd vektoren (3.300 bp) bruker en 0,8% agarose gel.
    5. Ligate de glødet oligo og renset fragmentet bruker T4 ligase 37 ° C: blanding 50 ng av fordøyd pRG2 og 1 ng av glødet oligo i en reaksjon mengde 20 μL. Ruge på RT i 15 min.
    6. Hemorroider blandingen forvandle DH5 alfa belastningen og vokse transformants på LB agar plater som inneholder ampicillin (100 μg/mL) på 37 ° C. Bekreft innsetting av oligo i vektoren ved standard sekvenser.
  2. Hva av plasmider koding Sniper-Cas9 og sgRNA
    1. Opprettholde HEK293T celler i DMEM med 10% FBS og 1% antibiotika på 37 ° C med 5% CO2. Dagen før transfection, trypsinize og telle celler. Når du arbeider med en 48-og skala, plate 1 x 105 celler per brønn i 250 μL komplett oppblomstringen medium. Cellene skal 50-80% confluent ved transfection.
    2. I 48-og skala, forberede 250 ng p3s-Cas9 plasmider og 250 ng av sgRNA plasmider for hva, bruker en lipid-baserte transfection reagens. Bland plasmider i 25 μL serum gratis-MEM.
    3. Fortynne 1 μL transfection reagens med 25 μL serum gratis-MEM. Inkuber blandingen på RT for 5 min. kombinere de to blandingene og ruge den resulterende løsningen på RT for 20 min til skjemaet plasmider-lipofectamine komplekser.
    4. Etter 20 min med inkubering, tilsett 50 μL av løsningen inneholder plasmider-transfection reagens komplekser direkte til hver vel inneholder celler, og bland forsiktig av rocking platen frem og tilbake. Inkuber cellene på 37 ° C i en CO2 inkubator for 48-72 h innlegget transfection før assaying transgene uttrykk.

8. beregning av indel frekvenser for å fastslå på målet og off-målet

  1. Målrettet dyp sekvenser for analyse av på mål og potensielle off-målet områder
    1. Isolere genomisk DNA fra trinn 6.1.5 eller 7.2.4 med en gDNA forberedelse kit. Generere dyp sekvensering biblioteker ved PCR forsterkning av gDNA med primer på målet og off-målet.
    2. Bruk indeks primere merke hvert utvalg. Underlagt gruppert biblioteker sammen-end sekvensering bruker en neste generasjons sekvensering maskin.
  2. Dyp sekvensering analyse bruker Cas-analyserer
    1. Analysere dyp sekvensering data bruker Cas-analyserer vurdering verktøyet17.
    2. Velg Fastq filene under kategoriene lese 1 og Les 2 (Les 1 = XX_SXX_L001_R1_001.fastq, Les 2 = XX_SXX_L001_R2_001.fastq).
    3. Fyll ut kategorien Grunnleggende informasjon og kategorien Parametere for forretningsanalyse klikker Send -knappen.

Representative Results

Etter Sniper-skjermen er utført, kan prosentandelen av overlevelse kolonier beregnes ved å dele antall kolonier på LB plate som inneholder chloramphenicol, kanamycin, arabinose og ATC (CKAA) antall koloniene i LB platen inneholder chloramphenicol og kanamycin bare (CK). Denne prosentandelen var vanligvis svært lav når Sniper-skjermen ble utført med bibliotekene i SpCas9. Sann-positive treff kan bli beriket med gjentatte skjermen med bevarte bassenget. I denne representant Sniper-skjermen, for eksempel ble en 100% overlevelse innhentet etter det tredje skjermbildet (figur 1). Transfections bruker RNPs eller plasmider-kodet Sniper-Cas9 kan gjøres for ulike mål og det resulterende på målet og off-målet aktiviteter målt ved målrettet amplicon sekvenser (figur 2). Høyst mål, Sniper-Cas9 viser samme nivå på målet aktiviteter og høyere spesifisitet prosenter sammenlignet med WT. Truncated sgRNAs kan også brukes til å forbedre spesifisitet (Figur 3). Men er deres bruk begrenset til bare noen mål fordi de fører lav på målet aktiviteter i forhold til full lengde sgRNAs, i de fleste tilfeller. Derfor sgRNAs med varierende lengde (fra 17 - til 20-mers) må testes og både på målet og off-målet må måles for å optimalisere spesifisitet.

Figure 1
Figur 1: representant Sniper-skjermer utført med forskjellige biblioteker tilfeldig Cas9 varianter. Mutator bibliotek, EP biblioteket jeg, og EP biblioteket II angi biblioteker laget ved hjelp av ulike kommersielle kits. Første, andre og siste angir antall ganger berikelse skjermen var utført7. Dette tallet er endret fra Lee et al.7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: på målet og off-målet aktiviteter WT-Cas9 eller Sniper-Cas9 sammen med en 20-mer guide sekvens levert via plasmider eller RNP. Spesifisitet prosenter ble beregnet ved å dele på målet aktiviteten av aktiviteten off-målet. Feilfelt viser SEM (n = 3)7. Dette tallet er endret fra Lee et al.7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: på målet og off-målet av Sniper-Cas9 forhold til WT-Cas9 får sgRNAs med variable lengder målretting webområdene FANCF01 og AAVS. Spesifisitet prosenter ble beregnet ved å dele indel frekvenser på på målet områder av dem på respektive off-målet nettsteder. sgRNAs med en samsvarende guanine på 5' terminus (GX18 eller GX19) og de med en guanine (gX17, gX18, gX19 eller gX20) angis. Spesifisitet forholdstall var ikke beregnet når normalisert på målet aktiviteter var < 70%7. Dette tallet er endret fra Lee et al.7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

For de som ønsker å unngå tungvint screening prosedyrer for å få Sniper-Cas9, er snikskytter-Cas9 protein og koding plasmider tilgjengelig. Med disse materialene hvor optimal sgRNA, som gir den høyeste spesifisitet forholdet, bør fastsettes. I tillegg anbefales Sniper-Cas9 og sgRNA i et RNP format fordi det vanligvis resulterer i høyere spesifisitet innsats enn levering i plasmider format. I motsetning til Sniper-Cas9 er andre foretatt Cas9 varianter ikke kompatible med avkortede sgRNAs6,7 eller levering i RNP skjemaet8 (med unntak av HiFi-Cas9).

For Sniper-skjermen er valg av mismatched sekvensen viktigste. Valg av en sgRNA som er forbundet med lav cleavage aktivitet mot GOI sekvensen bør unngås. Hvis ikke, Cas9 varianter med et WT spesifisitet vil ikke holde seg E. coli genomisk DNA med feilaktige målområdet. Denne effekten vil resultere i et stort antall bakgrunn kolonier, jeopardizing hele screening prosedyre.

Fordi E. coli har en rask er dobling tid og høy transformasjon effektivitet sammenlignet med gjær, Sniper-skjerm en fordel sammenlignet gjær-basert screening metoder. I tillegg, Sniper-skjermen bør være mer følsomme enn andre E. coli-baserte systemer der webområdet er gjennomført på en plasmider: finnes det én kopi av genomisk DNA, og dermed bare én kopi av webområdet ikke samsvarer i systemet vårt, men et stort antall plasmider innenfor en enkelt E. coli -cellen.

Spesifisiteter av andre DNA endonucleases som induserer DSBs, for eksempel SaCas9 eller Cpf1s, kan også forbedres ved hjelp av Sniper-skjermen. Dessverre, Sniper-skjermen kan ikke brukes til å øke spesifisiteten av base redaktører direkte, fordi base redaktører ikke Fremkall DSBs i genomic DNA av E. coli. Som base redaktører bruker nickase eller død versjon av Cas9 i kjernen av deres system, kan særegenheter av base redaktører økes ved hjelp av treff fra Sniper-skjermen.

Disclosures

ToolGen har arkivert en patent (PCT/KR2017/006212) dekker Sniper-skjermen (status: venter, oppfinner: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung og Euihwan Jeong er ansatte i ToolGen, Inc.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra departementet for vitenskap og IKT-Korea (2017M3A9B4061406) og National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av koreanske regjeringen (MSIT) (grant tall 2017M3A9B4061404 og 2018M3A9H3020844) å Jungjoon K. Lee. Plasmider koding pGRG36 var en gave fra Nancy Craig (Addgene plasmider #16666) p11-LacY-wtx1 var en gave fra Huimin Zhao.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) NEB M0290L
Ampicillin Sodium Salt Fisher Chemical BP1760-25
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma Aldrich 37919 or 94664
Antibiotic Antimycotic solution Welgene LS203-01 Media component
BamHI Enzynomics R003L
Chloramphenicol Sigma Aldrich R4408
Diversify PCR Random Mutagenesis Clontech 630703 Error-prone PCR kit
DNA-Shuffling Kit Jena Bioscience PP-103
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM001-17 Culture media
Endura Electrocompetent Cells (DUO) Lucigen 60242-2 E. coli electrocompetent cells for library preparation
Fetal Bovine Serum (FBS) Welgene S101-01 Media component
Gene Pulser II Bio-Rad E. coli electroporation equipment
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit Agilent 200550 Error-prone PCR kit
genomic DNA prep kit GenAll 106-152 gDNA-prep kit
Glycerol BioShop GLY001.1
GP/MP Cuvette, 0.1cm Bio-Rad BR165-2089 E. coli electroporation equipment
HEK293T cell ATCC CRL-11268 Human cell line
Kanamycin sulfate Acros Organics 450810500
L-(+)-Arabinose Sigma Aldrich A3256-25G
LaboPass PCR Purification Kit Cosmogenetech CMR0112
LaboPass Plasmid Mini Cosmogenetech CMP0112 Mini-prep kit
LB Agar Miller Formedium LMM0202
LB Broth Miller Formedium LMM0102
Lipofectamine Invitrogen 11668019 Transfection reagent
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture
Neon Transfection System Thermo MPK5000 RNP Electroporation equipment
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo MPK1096 RNP Electroporation equipment
NucleoBond Xtra Midi EF Macherey-Nagel 740420.50 Midi-prep kit
Oligo Clean & Concentrator Zymo Research D4061 DNA purification kit that enables low-volume elution
Opti-MEM Gibco LS31985070 Transfection media
p11-lacY-wtx1 Addgene #123945
pgrg36 Addgene #16666 E. coli mutator strain
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530L
Pyrophophatase NEB M2403L
Ribonucleotide Solution Set NEB N0450L
RNase inhibitor NEB M0314L
T7 RNA polymerase NEB M0251L
Turbo Dnase Ambion AM2238
XbaI Enzynomics R013L
XL1-Red Competent Cells Agilent 200129

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
  2. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  3. Chen, J. S., et al. Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy. Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).
  4. Kleinstiver, B. P., et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).
  5. Slaymaker, I. M., et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
  6. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  7. Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
  8. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  9. Anderson, K. R., et al. CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice. Nature Methods. 15, 512-514 (2018).
  10. Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides. Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).
  11. Kulcsar, P. I., et al. Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage. Genome Biology. 18 (1), 190 (2017).
  12. Zhang, D., et al. Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases. Genome Biology. 18 (1), 191 (2017).
  13. McKenzie, G. J., Craig, N. L. Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event. BMC Microbiology. 6, 39 (2006).
  14. Geissmann, Q. OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects. PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).
  15. Chen, Z., Zhao, H. A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases. Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).
  16. Kim, S., et al. CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells. Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).
  17. Park, J., et al. Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data. Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).
  18. Studier, F. W., et al. Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes. Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).

Tags

Genetikk problemet 144 Sniper off-målet på mål CRISPR Cas9 RNP plasmider
Bruke Sniper-Cas9 å minimere Off-målet effekter av CRISPR-Cas9 uten tap av på målet aktivitet Via regissert evolusjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, J., Jung, M. h., Jeong, E.,… More

Lee, J., Jung, M. h., Jeong, E., Lee, J. K. Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution. J. Vis. Exp. (144), e59202, doi:10.3791/59202 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter