Summary
Vivo memeli modellerinin kritik ölçekli kemik defektleri ortopedik tedavi ve şifa mekanizmaları eğitim araştırmacılar için gereklidir. Burada, bir protokol tekrarlanabilir, gelen bir segmental, femur kusurları eksternal fiksasyon kullanarak stabilize Sıçanlarda oluşturulması için tanıtmak.
Abstract
Ortopedik araştırma ağır kemik içinde vivo şifa mekanizmaları çalışma gibi yeni tedavi teknikleri araştırmak için hayvan modellerinde dayanmaktadır. Segmental kusurları kritik ölçekli klinik olarak tedavi etmek için zorlu ve araştırma çabalarının güvenilir, Ambulatuvar küçük bir hayvan model bir segmental femur kusur faydalanabilir. Bu çalışmada, biz bir eksternal fiksatör ile stabilize bir sıçan uyluk bir 5 mm kritik diaphyseal kusur tutarlı ve tekrarlanabilir oluşturulması için en iyi duruma getirilmiş bir cerrahi Protokolü mevcut. Diaphyseal ostectomy 4 Kirschner telleri bicortically, yerleştirmek için özel bir jig kullanarak hangi bir adapte eksternal fiksatör aygıtla stabilize gerçekleştirildi. Salınan bir kemik testeresini kusur oluşturmak için kullanılan. Yalnız bir kollajen sünger veya rhBMP-2'de batırılmış bir kollajen sünger defekt implante ve kemik şifa 12 hafta boyunca ilerlemenin kullanarak izlenir. 12 hafta, sıçan kurban edildi sonra histolojik analiz eksize denetimde gerçekleştirilmiş ve kalça tedavi. RhBMP-2 tedavi bir remodeling periosteal duygusuz ve yeni kemik oluşumu vermiştir iken sadece kollajen sünger içeren kemik defektleri sigara-Birliği'nde, sonuçlandı. Hayvanlar implantasyonu sonrası de kurtarılan ve harici fiksasyon 12 hafta boyunca femoral kusurları sabitleme başarılı oldu. Bu aerodinamik cerrahi model kemik şifa çalışma ve test yeni ortopedik Biyomalzeme ve rejeneratif tedaviler içinde vivokolayca uygulanabilir.
Introduction
Ortopedik travma cerrahisi karmaşık kırıklar geniş bir tedavi üzerinde duruluyor. Kritik diaphyseal gelen bir segmental kemik kusurları klinik olarak çevreleyen kas ve kapaklarini azalma rejeneratif yeteneği hem de yetersizliği nedeniyle tedavi etmek zor kanıtlamıştır angiogenez1yerelleştirilmiş. Modern tedavi teknikleri, Kemik greftleme ile operatif fiksasyon içerir (Masquelet) Kemik greftleme, kemik taşıma, füzyon veya amputasyon2,3,4gecikmeli. Ambulatuar işlevi ile iyi işleyen distal ekstremitelerde, onların travma sonrası korunmuş olan çoğu hasta uzuv hurda açıkça daha iyi bir tedavi seçeneği5mevcuttur. Bu hurda tedaviler genellikle uzun tedavi boyunca aşamalı cerrahi müdahaleler gerektirir. Bazı yazarlar bu eksternal fiksasyon implante internal fiksasyon azalmış doku hasarı nedeniyle bu uygulamalar için azalmıştır implantasyon sırasında yüzey alanı ve artan Postoperatif olarak ayarlanabilir, ile karşılaştırıldığında üstün olduğunu düşündürmektedir fiksatör6. Ancak, bir prospektif randomize kontrollü bu tartışmalara ciddi açık kırık tibia7eksternal fiksasyon karşı iç gidermek için şu sıralar başlatıldı. Ne yazık ki, seçili her iki tedavi ile önemli komplikasyon ve başarısızlık oranları8,9devam etmektedir. Segmental kemik kaybı ile ilgili olarak her iki tedavi yöntemi ile cerrah önemli sorunlar mevcut gelen bir segmental diaphyseal kusurları ile uğraşmak zorundadır. Düzeltmeler segmental kusurların kemik sabitleme en üst düzeye çıkarmak ve aynı anda Osteojenik işlemi10,11geliştirmek gerekir.
Klinik önemi nedeniyle, henüz kritik ölçekli diaphyseal gelen bir segmental kusurların düşük ses etkili bir tekrarlanabilir bir hayvan modelini tedavi teknikleri geliştirmek ve sonuçta klinik sonuçlar geliştirmek araştırma ekipleri etkinleştirmek gereklidir. Araştırmacılar vivo içinde fizyolojik şifa mekanizmaları bir memeli hayvan modelinde çalışması gerekir. 12,13,14,15eksternal fiksasyon zaten böyle modelleri mevcut iken, tedavi edilmeyen hayvanlarda seçimi ile azalma maliyetleri sendikalar için daha güvenilir bir yöntem sağlamak umut uygun fiyatlı fiksatör malzeme ve anahat gelecek çalışmalar kolay uygulaması basit bir cerrahi protokolü. Bu iletişim kuralı öncelikli hedefi de, fareler bir kritik diaphyseal kusur bir güvenilir ve tekrarlanabilir model kurmaktır. Prosedürü sabitleme ve sıçan uyluk içinde 12 hafta boyunca şifa kemik değerlendirilmesi tarafından incelendi. Dahil ikincil hedefleri: cerrahi yaklaşım ve sabitleme basitleştirmek ve sağlanması uygun bir model olarak bir maliyet etkin olarak olası, hayvan bakımı etik yapma. Yazarlar ve araştırma ekibi ile farklı Biyomalzeme ve segmental bu üründe şifa geliştirmek için potansiyel rejeneratif tedaviler bir dizi ön deneyler yaptı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan fareler travma yönergelere uygun olarak günlük bakım ötenazi hayvanlar için alınan: 2013 Edition16. Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Wisconsin-Madison Üniversitesi değerlendirildi ve proje başlamadan önce bu deneysel protokol onayladı.
1. hayvanlar
- Yaklaşık 350 gr ağırlığında outbred Sprague-Dawley erkek rats kullanın.
2. hazırlık, kemik morfogenetik Protein-2 (rhBMP-2) batırılmış sünger iskele
Not: İskele hazırlık femur implantasyon hemen önce gerçekleşmesi gereken (bkz. Adım 6,14).
- Kollajen sünger, liyofilize rhBMP-2 ve sulandırma17için steril su içeren bir kurulan rhBMP-2 kemik greft kit kullanımı için üreticinin yönergelerini izleyin. Kısırlık Bakımı, rhBMP-2 için bir konsantrasyon 1.5 mg/mL steril su ile yeniden oluşturma.
- Steril makas ve steril bir cetvel, 5 mm x 3 mm x 3 mm kusur sığacak şekilde yeniden şekillendirmek için rhBMP-2 sırılsıklam kollajen sünger gelene dek kırpın.
- Böylece bu emilir kullanarak, rhBMP-2 çözüm kollajen sünger üzerinde eşit olarak dağıtabilmenizi.
3. özel eksternal fiksasyon aygıt hazırlanması
Not: 1A rakam boyutları daha tam listesi için bkz.
- Alüminyum levha stok (türü 6061, 0,088" kalınlığı) 2-kesilmiş parçalar (1.4" x 6") bir Yapboz veya diğer uygun aracı kullanarak.
- Freze makinesi tek parça monte ve bir 1/8" 90 °-nokta karbür matkap değirmen kullanılarak, dört 'V' grooves (0.035" derin) kesme boyuna. Diğer parça keser özgür bırakın.
- Genişliğinin 0.3" iki bireysel plakalar kesilmiş parçalar (şekil 1B). Ölçü ve Matkap üzerindeki vida delikleri 4-40 iş parçacığı için. 4-40 iplik ile 'V' yivli plaka dokunun. #4 vida vücut tatbikat oluklar olmadan plaka matkap.
- Köşeleri yuvarlak ve ağırlığı (şekil 1 c) azaltmak için iki adet kum.
- Oluklar düz plaka (şekil 1 d) karşı aynı hizada olması ile birlikte 4-40, 18-8 paslanmaz çelik düğmesini baş cap vidaları (0,25") adet vida
4. anestezik yordam ve Analjezi
- Anestezi indüksiyon Odası 4 L O2/min ile % 4 isoflurane teslim fareyi yerleştirerek neden.
Dikkat: Araştırma personeli anestezik gaz zehirlenmesinden önlemek ve uygun başlık ve havalandırma Laboratuvarı korumak gerekir. - Fareyi iyileştiren refleks kaybeder sonra fareyi odasından kaldırın, burun konisi eklemek ve idame dozu anestezi (O2 teslim oran için 2-3 L/dak ve % 0,8 isoflurane) burundan yerleştirin.
- Fareyi Isıtma yastığını veya hipotermi önlemek için Isınma ışık altında ekleyin.
- Anestezi yeterli derinliği parmak pinching veya palpebral refleks testi onaylayın.
- Yağlama gözleri kornea dışarı kurutma önlemek için geçerlidir.
- Genişletilmiş sürüm buprenorfin (1 mg/kg) bir subkutan enjeksiyon gövde/patolojisi analjezi sağlamak ilâ 3 gün boyunca ameliyatı takiben cerrahi siteye, uzakta sıçan sunmak.
5. aseptik hazırlık ve antibiyotik preventatives
- 13inci kaburga, ayak, dorsal orta hat ve ventral orta hat kenar boşluklarını kullanmak hindleg çevresini tıraş.
- Traş fırçalayın alanı % 10 povidone-iyot % 70 oranında takip ile batırılmış steril 2 x 2 gazlı bez kullanarak alkol (4 kez her biri, alternatif).
- Sülfadiyazin (20 mg/kg) bir kas içi enjeksiyon içine operatif kuadriseps yönetmek.
- Enrofloksasin (0.25 mg/ml) içme suyunda postoperatively sürekli antibiyotik koruma için 7 gün için yönetmek.
- Fareler PIN yolu enfeksiyonları önlemek için çalışma süresi için tıbbi besleme (örneğin, Uniprim) yerleştirin.
- Çift Kişilik antibiyotikli bir krem cilt-pin arabirim için bir kez her gün postoperatively 3 gün boyunca geçerlidir.
Not: herhangi bir harici fiksasyon PIN önlemek veya hangi enfeksiyon gelişmesine katkıda bulunabilir gevşeme kelepçe.
6. cerrahi müdahale
Not: uyumlu bir çaba bir steril alan ve çalışma alanı korumak ve steril tekniği kasanın tamamı boyunca takip edin.
- Delikli, açık yapışkan örtüsü ve steril bir alan oluşturmak için steril havlu kapak cerrahi tezgah traş bacak uzatmak.
- Uyluk kemiği muayene et ve proksimal femur, büyük trochanter patella uzanan deri yoluyla anterolateral kesik oluşturmak için #15 bıçak kullanın.
- Dikkatle yanal bacak fasya yanal uyluk maruz kadar vastus okuli kas kuadriseps, anteriorly hamstrings özafagusu ayırmak için intermuscular septum boyunca deşmek. Büyük trochanter tarihinde kaçıran gluteal tendon ekleme korumak.
- Dikkat et, Atravmatik sirkumferansiyel yumuşak doku diseksiyon gerçekleştirmek ve yanal yüzeyde başlayan onun orta diaphysis, femur bulaşmasına neden. Bunu yapmak için #15 bıçak bıçak kemik yüzeyine kontur karşı paralel tutarak temel kemik uzak kas hafifçe kesmek için kullanın. Kas maruz kemik uzak disseke gibi kaldırıp ulaşana kadar 7-10 mm Merkezi diaphysis, yumuşak doku ostectomy için hazırlamak için tüm tarafların temizlenmiş oldu femur şaft devam periosteal asansörü kullanın.
Not: medial femoral nörovasküler demet yaralanma kaçının. - Dört 1.0 mm Kirschner (k) teller takın: 2 proksimal ve 2 lateral femur dikey femur distal medial için düz lateral yönetti. Her iki cortices (bicortical) yeterli istikrar (şekil 2A) için tüm pins meşgul olun.
- En distal iğne ile ilk, sadece lateral epicondyle düzeyinde başlar. Yer jig yanal distal femur boşaltır ve 1.0 dişli ucu k-dinleme cihazı takın.
- Kemikteki jig konumunu koruyarak, en proksimal PIN jig delikleri alan kemik girmek nerede tanımlayın. Konum belirlendikten sonra dikkatle paralel gluteal tendon lifleri için doku geçmesine, proksimal pin için küçük bir boşluk oluşturmak için gerektiğinde böylece tendon iyatrojenik zarar en aza indirerek deşmek. 1.0 mm evreli olmayan k-tekrar pin her iki cortices (şekil 2B) yürütmektedir sağlanması dinleme cihazı bu boşluğu içinde matkap.
- Kemik ile temas halinde görürse oyun konumunu korumak ve iki 1.0 mm dişli k-telleri, gelecekteki kusuru sitesinde her iki tarafında bir matkap. Her iki cortices (şekil 2C) iğne meşgul olun.
- Düzey 1 cm cilt üzerinde bar eksternal fiksatör yerleştirin ve sıkıca, yer çubuğunda kilitleme canı cehenneme. Aşırı PIN uzunlukları (şekil 2B) küçük.
- Ostectomy (kusur oluşturma) için küçük, eğri Retraktörü anterior ve posteiror uyluk çevresinde yerleştirerek çevreleyen yumuşak dokusu, kas ve nörovasküler demet korumak için hazır olun. ~ 5 mm sagittal salınan kullanan testere, çok dikkatli bir 5 mm segmental kusur orta diaphysis aracılığıyla oluşturun. Bir ışık, gereksiz kırığı (şekil 2E) önlemek için testere ile bile basınç uygulayın.
- Termal Kemik nekrozu önlemek için kusur oluşturulurken sulama (oda sıcaklığında % 0,9 steril normal salin (NS)) gerektiği gibi az miktarda uygulayın.
- Defekt oluşturduktan sonra NS 10 mL kullanarak yara floş.
- 0.1 mL % 0.25 bupivacaine epinefrin (1: 200, 000) ile bir analjezik ve vasoconstrictor olarak yara için yönetmek.
- INSERT kollajen sünger veya rhBMP-2 (5 x 3 x 3 mm) İskele defekt içine ( Adım 2) üzerinden sünger batırılmış. Her iskele uzunluğu ve konumda kalın sünger yardım kusur, hacmi yayılmasını uygun boyutta olması.
Not: Bu noktada, mRNA kompleksleri hazırlanacak ve bioluminescence görüntüleme gerçekleştirmek eğer 7,1-7,3 aşağıdaki adımlarda açıklandığı şekilde enjekte. - 4-0 absorbe dikiş ile basit kesintiye uğramış desen kullanarak kas uçak kapatın. 4-0 absorbe dikiş ile çalışan bir subcuticular düzeni kullanmak cilt katman kapatın ve çıkıntılı pimleri etrafında boşlukları kapatmak için tutkal cilt.
- Burun konisi, Isıtma yastığını üzerinde kalan fareyi kaldırın ve sürekli fare sürekli dik bir duruş korumak için güçlü olana izlemek. Bu noktada, kurtarmak için temiz bir kafese koyun.
7. complexed mRNA ve bioluminescence görüntüleme hazırlanması
Not: Transfection mRNA kompleksleri ile ameliyat 1 gün öncesine ışıldama görüntüleme sırasında yapılmalıdır. Steril teknikleri mRNA işlerken kullanın.
- Mix 10 µL mRNA lipidik transfecting Aracısı 30 µL ile Gaussia luciferase (hisse senedi konsantrasyon 1 µg/µL) için kodlama.
- Forma mRNA-lipid kompleksleri için oda sıcaklığında en az 5 min için kuluçka tarafından izin. Lipidik transfecting Ajan mRNA molekülleri onları istikrarı ve transfection verimliliği arttırmak yoğunlaşmak.
Not: kompleksleri hemen kullanılmazsa, onları buz en fazla 1 saat için saklayın. - Filtre uygulanmış ipuçları ile donatılmış bir 20 µL pipet kullanarak, mRNA kompleksleri defekt, distal ve proksimal uçları birimin sırasıyla enjekte et.
- Ertesi gün, görüntüleme önce 3 dk inhale isoflurane adım 4.1 daha önce açıklandığı gibi kullanarak fare anestezi.
- Fareyi bir bakım isoflurane (% 0,8 isoflurane, O2 teslim oranı 2-3 L/dak) teslim bir burun konisi ile donatılmış oda Imaging vivo yerleştirin.
- Coelenterazine 4 mg/kg vücut ağırlığı defekt birbirine bir doz, serum resuspended enjekte.
- Bioluminescence görüntüleri görüntüleme sistemi (İVIS) göre üreticinin yönergeleri18 in vivo elde.
8. görüntüleme Protokolü
- Düz Radyografi makine, bir x-ışını sistemi19, ayarlama sonra anestezi inhale isoflurane yukarıda açıklanan (bkz: Adım 4.1) kullanarak fare ve fare ile inhale isoflurane (% 0,8 isoflurane, O2 burun konisi yerleştirin teslimat oranı 2-3 L/dak) için bir hastanın (AP) uyluk grafisi.
- Fareyi sternal recumbency, cerrahi hindlimb ileri, kalçada esneme ilerlemek ve ortak bastırmak. Yaklaşık 90 ° bastırmak ortak esnek. Pençe plantar yan aşağı, vücut duvara yakın teyp. Uyluk kemikleri superimposing olasılığını ortadan kaldırmak için gelen tibia öne getirin. Kalça hafif kaçırma sağlamak için kasık bölgesinde yarı saydam sünger (yaklaşık 15 mm kalınlığında) yerleştirin. Sonra uyluk ön-arka (Kaudal kafatası) görüntüsünü elde etmek.
- Bu AP uyluk radyografik görünümü hemen ardından cerrahi, 4 hafta ve 12 hafta tekrarlayın. Gazlı bez ve bant hayvanın ekstremite kalite ve tutarlı görüntüleme için uygun şekilde konumlandırmak için kullanın.
- Burun konisi fareyi kaldırın ve sürekli fare sürekli dik bir duruş korumak için güçlü olana izlemek. Sonra kafesin içine yerleştirin.
9. histolojik yordamı
- Fareler ile inhale CO2 travma etik standartları16göre bir odasında ötenazi.
- Aşağıdaki ötenazi, hindlimb tıraş, Cilt operatif ekstremite kaldırmak ve uyluk, kalça disarticulate. Dikkatli bir şekilde tüm yumuşak doku (tüm kas, tendon ve bağ da dahil olmak üzere) operatif uyluk çıkarın. Şifa bölge diseksiyon sırasında yanlışlıkla zararlardan korumak için kusur sitesi çevreleyen kas sadece ince bir tabaka bırakın.
- Uyluk kemiği % 10'luk yer tarafsız arabelleğe alınmış fiksasyon için izin vermek için Formalin 3-4 gün için oda sıcaklığında. 15:1 formalin doku hacim oranı için tutun. Çözüm fiksasyon işlemi boyunca yarıya kadar bir kez değiştirin.
- Uyluk kemiği bir çözümde % 15 Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 6,5 3-4 hafta boyunca decalcify. Kalsiyumun bitiş noktası belirlemek için seri halinde ilerlemenin toplamak.
- Uyluk kemiği boyuna bir kesim anterior posterior-sagittal düzlemde ile bisect. Doku standart parafin gömme ve Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyama için gönderin.
- H & E slaytlar bir patolog histolojik değerlendirme için gönder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ameliyat yaklaşık bir saat içinde bir Yardımcısı Yardımı ile bir cerrah tarafından gerçekleştirilmiştir. Cerrahi optimizasyonu sonra içi ve ameliyat sonrası komplikasyonlar Ģunları büyük ölçüde minimize ve tutarlı büyüklüğünü (5 x 3 x 3 mm) ve femur kusurların yerelleştirme jig cihazları kullanın. Fareler ve anestezi Ambulatuar hemen aşağıdaki kurtarma vardı değiştirilen herhangi bir davranış kalıpları için görünmedi; onların yürüyüş antalgic değildi ve eksternal fiksatör tarafından rahatsız edilmek görünmedi.
Proksimal toplu iğne-iplik telleri kullanıldığında kırma en yüksek riski olduğu gibi sigara iş parçacıklı k-telleri en proksimal-PIN (şekil 2B), seçilmiştir. Bazı durumlarda, özellikle denetiminde hayvanlar rhBMP-2 veya sünger görüldüğü gibi bir veya daha fazla k-tel ipuçları yaklaşık 8 hafta sonra kırdı şifa/kemik oluşumu, kanıtı yok olan kusur gösterdi iskele olmadan sadece grafisi eksize femur ( kontrol Şekil 3).
İlerlemenin ve Histoloji (H & E leke) kemik iyileşme düzeylerini değerlendirmek için analiz edildi. Negatif kontrol sadece bir kollajen sünger osteogenesis proksimal ve distal kemik kenarları (şekil 3, şekil 4) arasındaki köprüleme hiçbir kanıt gösterdi içeren kusurları. Yeni kemik şeklinin değiştiğine dair küçük bir miktar kesme uyluk kenarına bitişik görülebilir; kusur kendisi kemikli malzeme, kıkırdak varlığı ve bazı kalıntı Hematom (şekil 4) eksikliği gösterir. RhBMP-2 içeren kusur gösterdi sünger önemli kemik gibi erken 4 hafta sonra ameliyat, Radyoopak duygusuz şekil 3üründe arasında köprü oluşturma tarafından gösterildiği gibi şifa batırılmış. 12 hafta, önemli yeni mineral ifade tarafından (4 rakam, NB: yeni kemik, PC: periosteal duygusuz) kusur oluşturmuştur. Önemli yeni periosteal kemik duygusuz kesme uyluk kenarından uzanan görülebilir ve spicules dokuma ve lamel Kemik defekti geliştirdik. Kıkırdak ifade değildir (şekil 4) gördüm.
Histoloji (H & E leke) ayrıca virüs bulaşmamış bir denetimi ve virüslü bir uyluk kemiği (şekil 5) bir örnek için gerçekleştirildi. Virüslü uyluk önemli ölçüde genişletilmiştir endosteal kemik korteks infiltre reaksiyon belirtileri gösteriyor. Oklar Osteoklast aracılı patolojik kemik rezorpsiyonu alanları gösterir. Bulaşmamış uyluk korteks sık ve açıkça belirlendi bir lamel korteks ile kalır. Antibiyotik dozaj postoperatively maksimal kapsama dahil etmek için optimize edildi. Kusur site çevresinde enfeksiyon oluşabilir iken, antibiyotik topikal PIN çevresinde devam eden Yönetim siteleri ve su ve diyet ameliyat sonrası enfeksiyon minimize başarılı oldu.
Daha fazla In Vivo görüntüleme sistemi (IVIS) kullanarak Imaging kollarındaki hücreleri içinde defekt eksternal fiksatör (şekil 6) implantasyonu sonra görüntülenmeyecektir yeteneği gösterir. Dış plaka kolay görüntüleme için kaldırılır ve tamamlandıktan sonra değiştirilir. Complexed mRNA Gaussia luciferase için kodlama ile transfection sonra hücreleri medüller boşluğunda parlayan. Işıma en üst düzeyde femur kusuru sitesinde odaklanmıştır ve sinyal fiksasyon cihaz pimleri tarafından engel değil. Bu bioluminescence veya iyileşme süreci sırasında bir gen veya protein ifade gibi biyolojik değişiklikleri ölçmek için Floresans dayanarak gelecekteki çalışmaları için umut verici.
Şekil 1: Eksternal fiksatör imalat. A: Monte eksternal fiksatör uygun imalat için ek açıklama eklenen boyutlu CAD şeması. Her fiksatör birlikte iki vidayı tarafından düzenlenen iki alüminyum plakalar oluşmaktadır. B: tabak alt sayfası kesmek 'V' yivli 1.4 "x 6" alüminyum levhalar kesilir. C: vida delikleri (plaka 'V' yivli dişli) tabak içine delinmiştir ve tüm kenarları ve köşeleri yuvarlak ve ağırlığı azaltmak için zımpara. D: Monte eksternal fiksatör vidaları (4-40 x 0,25", 18-8 paslanmaz çelik düğmesini baş cap) ile sıkılır kez 'V' grooves alüminyum levha içi üzerinde bir yerde pimleri vardır. Sol PIN evreli olmayan ve en proksimal femur üzerinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Pin yerleştirme, fiksatör yerleştirme ve kusur oluşturma şematik. A: distal PIN (1.0 mm dişli k-tel) doğru PIN ekleme Kılavuzu için jig (mavi dikdörtgen) kullanarak epicondyle metaphyseal bölge yer alıyor. Jig anterolateral uyluk yüzey yerleştirilir. B: proksimal PIN (1.0 mm evreli olmayan k-tel) küçük bir insizyon attım gluteal tendon yaptıktan sonra jig kullanarak yerleştirilir. C: Orta iğneler (1.0 mm dişli k-tel) jig kullanarak eklenir. D: jig kaldırılır ve 2 tabak tabak güvenliğini sağlamak için 2 vidayı kullanarak pins bağlıdırlar. Tabakları cilt üzerinde baskı önlemek için deri seviyesinden 1 cm sıkılır. E: sagittal salınan testere 5 mm kusur iki orta pin arasında oluşturmak için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Temsilcisi yüksek çözünürlüklü ilerlemenin göster: rhBMP-2 tedavi ile şifa kemik. İmge için negatif kontrol kollajen sünger ve rhBMP-2 batırılmış sünger grupları 0, 4 ve 12 haftalıkken postoperatively gösterilir. RhBMP-2 tedavi grubunda duygusuz defekt kapsayan ile 4 hafta sonra önemli şifa sergiler. Negatif denetimi uyluk son kemik köprüleme ile iyileşmek değil ve bir sendikaya defekt kalır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Önemli yeni kemik oluşumu ile rhBMP-2 tedavi gördün mü. Temsilcisi 4 x büyütülmüş H & E histolojik adet fotoğraf negatif kontrol kollajen sünger ve rhBMP-2 için sünger grupları kesme uyluk kenarına ve kusur içinde batırılmış. Denetim uyluk kenar, ama önemli uzantıları hem yeni Trabeküler kemik hem de tedavi uyluk periosteal duygusuz projeden yeni kemik kurdu. Önemli kemik oluşumunu rhBMP-2 tedavi kusur görülebilir iken kemikli hiçbir malzeme kontrolü kusur içinde görülür. NB: yeni kemik, F: uyluk, C: kıkırdak, H: kanama, PC: periosteal duygusuz. Ölçek çubuğu: 200 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Infected uyluk sergileyen hipertrofisi ve inflamatuar hücre işaretleri. H & E histolojik görüntülerini virüslü bir uyluk kemiği, tam görünümünde ve 4 x büyütme kutulu yerlerin göre virüs bulaşmamış bir uyluk kemiği. Bulaşmamış femoral korteks organize ve belirlendi, inflamasyon küçük işareti ile kalır. Virüslü uyluk kemiği tam ekran olarak görüldüğü gibi büyük ölçüde büyütür ve korteks alanları rezorpsiyonu ve nekroz (siyah oklarla gösterilen mor hücre kümeleri) tarafından kadar bozuldu. F: kalça kemiği. Ölçek çubuğu: 200 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Gaussia luciferase sinyali üründe algılandı. Işıma hücre mRNA IVIS ile dış plaka kaldırıldıktan sonra yansıma Gaussia luciferase ile transfected. Kırmızı femur kusuru sitesinde en yüksek ışıma yoğunluk gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Küçük hayvan modelleri tam Kemik kırıkları gibi ortopedik yaralanma mekanizmaları osteogenesis ve Biyomalzeme20tedavi potansiyelini değerlendirmek araştırıyor araştırma etkinleştirin. Bu çalışmada bir sıçan tanıttı segmental kusur modeli stabilize bir laboratuar ve Biyomedikal Mühendisliği ekibi kolayca daha fazla taşıma osteosynthetic kemik onarım çalışmaları için yeniden oluşturabilirsiniz özel bir eksternal fiksatör tarafından.
Önceki çalışmalarda kritik ölçekli kusur fare modellerinde genellikle kullanarak internal fiksasyon tabak21,22,23,24tarihinde güveniyor. Her iki fiksasyon yöntemi klinik olarak kabul edilebilir olsa da, eksternal fiksasyon daha az yumuşak doku bozulması ve bakteriyel kolonizasyon için fırsatlar en aza indirmek için toplam implante yüzey alanı azalan kan kaybına neden farklı avantajları vardır, ve ameliyat sonrası olarak ayarlanabilir ve aşamalı cerrahi müdahaleler6için izin. Önceki eksternal fiksasyon hayvan kırık modelleri farklı plaka malzemeler, PIN güvenliği ve/veya kemik kesme yöntemleri12,13,14kullandık. Çünkü bu protokolündeki eksternal fiksatör ile düşük maliyetli alüminyum laboratuar atölye yılında yapıldı ve kolayca yenilenmiş, giderleri minimize. Bu ekonomik bir eksternal fiksatör araştırmacılar birden fazla hayvan grupları ile deneyler ezelî varlık mahdut mali olarak gerçekleştirmek sağlar sağlar. İnternal fiksasyon modeli ile karşılaştırıldığında, bu sistem teknik olarak daha basit ve daha küçük bir hayvan modelinde tekrarlanabilir olduğuna inanıyorum. Bizim deneyim ile bu modeller, internal fiksasyon teknik olarak önemli ölçüde daha fazla talep olduğunu ve özel işlenmiş implantlar gerektirebilir. Yazarların kadarıyla, bu genel iletişim kuralı benzersiz bir adapte metal eksternal fiksatör tasarım15ile birlikte özel tasarlanmış bir jig onun kullanımında, salınan bir kemik kullanımı için daha iyi gördüm yanı sıra ortak klinik senaryoyu temsil periosteal sıyırma kırık siteleri fiksasyon için hazırlamak için gerçekleştirilen. Bu modelde salınan bir testere kullanımı son bir not üretilen ısı ve oluşur periosteal bozulma sendikasız modeli şekillendirme kontrol nihai bir unsuru sağlamasıdır. Bizim deneyim diğer yöntemleri ile bu hayvan modellerinde, müfettişler şifa denetimleri riski vardır ki oldu.
Cerrahi başarı sağlamak için birkaç önemli adımlar özen gösterilmelidir: incising ve uyluk kas, çevreleyen üzerinden ortaya çıkarmak için çevresel diseksiyon gerçekleştirme kaçının zaman rahatsız edici siyatik caudally, femur damarları da, sinir ve gluteal tendon uzağından. Jig aparatı paralel getirin ve böylece tüm iğne kemiğe tam olarak dikey düz karşı anterolateral yüzü femur floş için dikkat ediniz. Bu eksternal fiksatör doğru hizalaması onaylamak ve PIN kırılma olasılığının azaltılmasına. Pin yerleştirme sırasını en kolay olması için ilk olarak, proksimal tarafından takip distal ve sonra her ikisi de iğne orta bulundu. Bu proksimal pim gluteal tendon daha az bozulma için izin verdi. Son olarak, her PIN bicortically yerleştirilir önemlidir, böylece o does değil her iki cortices delici veya kemik dışında geri medüller boşluğuna kayması.
Bir röntgen cihazı yüksek çözünürlüklü Radyografi yetenekli nitel değişiklikler kolayca ve non-invaziv zamanla görüntülenmeyecektir gibi kemik şifa durumunu izlemek için kullanıldı. Ancak, tutarlı bacak konumlandırma konumlandırma farklılıklar yanıltıcı olabilir doğru radyografik yorumu için çok önemlidir. Bu çalışmanın sonuçları 5 mm femur kusur kendiliğinden kemik normal sıçanlar25şifa engeller gösteren önceki çalışma ile anlaşma vardır. RhBMP-2 batırılmış gibi bu nedenle, herhangi bir deyişle şifa eklenen terapileri ile sünger kesin olarak anılan sıraya göre tedavi (şekil 3) bağlanabilir kaydetti.
Bu tekniği için olası endişeleri PIN kırılma, gevşeme ve enfeksiyon içerir. Proksimal PIN kırılma ön test ile ilgili sorunlar bir geçiş evreli olmayan için dişli k-tel-e sevketmek. Sigara dişli iğne mekanik olarak daha güçlü ama aynı zamanda korteks yedeklemek daha fazla riskli. Özellikle boş kemik defektleri, k-telleri kopabilir veya yaklaşık 8 hafta uzun süreli döngüsel PIN yükleme ve (benzer şekilde Bisiklete binme/ataç bükme için) şifa eksikliği nedeniyle yerinden. Sıkı bir antibiyotik alay bir acil sülfadiyazin enjeksiyon, günlük uygulama 7 gün ekleniyor içme suyu ve tıbbi bir besleme Enrofloksasin kesi yerinde, antibiyotik merhem içerecek şekilde kullanılmıştır. Yukarıda, uygun cerrahi teknikleri ile birlikte bu antibiyotik protokolü en aza enfeksiyon (şekil 5).
Kusur ve görüntüleme sonra replasman Engelsiz bir görünümünü kolayca kaldırılmasına eksternal fiksasyon bir hayvan modelinde kullanarak ek yararları biridir. Bu daha etkili içinde vivo floresan veya değişiklikleri gibi gen veya protein ifade değerlendirme ışıldama güvenerek teknikleri görüntüleme sağlar. Örneğin, hücre complexed mRNA Gaussia luciferase için kodlama ile transfected medüller boşluğunda IVIS ile görüntülenmeyecektir göstermiştir. Şekil 6 ışıldama sinyal algılama becerisi bu eksternal fiksasyon yaklaşım tarafından iç Kaplamalar, vidalar, olabilir veya21,22,23 intramedüller çivi gibi engel değil göstermektedir , 24. bu maliyet etkin ve tekrarlanabilir cerrahi Protokolü tutarlı oluşturma ve bu karmaşık kırıklar ilk klinik yönetiminin taklit eden kritik ölçekli femur kusur istikrar sağlar. Güvenilir bir hayvan modeli nihai klinik kullanıma yönelik herhangi bir deneysel tedaviler için kritik bir tesistir. Bizim modeli, tahmin edilebilir sonuçları ve en az davranış değişiklikleri veya rahatsızlık bizim hayvanlarda göstermiştir. Bu model ile birlikte iskele biomaterial tabanlı çeşitli kağıt bu gelecekteki translasyonel sınama amaçları için kullanılan görüntüleme teknikleri ile kullanılabilir. Bu model ile çalışma, araştırmacılar kritik kemik defektleri travma hastaları tedavi etmek için yeni yollar bulmak mümkün olacak bizim umudumuz. Bu morbidite kaçının ve şu anda istihdam uzun tedavilerde mal ve muhtemelen amputasyon sayısını azaltmak yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya yararları bildirin. Doğrudan veya dolaylı olarak bu makalede yazarlar tarafından alınan hiçbir faydaları olmuştur.
Acknowledgments
Bu eser bir NIH ekipman hibe 1S10OD023676-01 tarafından University of Wisconsin'ın ortopedi bölümler ve Rehabilitasyon ve Tıp Fakültesi ve halk sağlığı ile sağlanan ek desteği ile desteklenmiştir. UW'ın Carbone Kanser Merkezi destek hibe P30 CA014520 ve onların küçük hayvan Imaging tesisi yanı sıra NIH eğitim Grant 5T35OD011078-08 kullanım destek H. Martin için kabul etmek istiyorum. Biz de Michael ve Mary Sue Shannon kas-iskelet rejenerasyon ortaklık verdikleri destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, Ł, Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R.
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children's Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), Berlin. 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- Living lmage Software. , Perkin Elmer. (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
