Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Summary

Hier, zwei mittleren Durchsatz-Assays für die Bewertung der Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliche Spermien werden beschrieben. Diese Tests können verwendet werden, um schnell und einfach große Mengen von Verbindungen für Auswirkungen auf Ca^{2 +}Bildschirm-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma.

Abstract

Ca^{2 +}-Signalisierung ist für normale Spermien Zellfunktion und männliche Fruchtbarkeit. Ebenso ist die Akrosom Reaktion entscheidend für die Fähigkeit einer menschlichen Samenzelle, die Zona Pellucida zu durchdringen und das Ei zu befruchten. Es ist daher von großem Interesse für die Verbindungen (z. B. Umweltchemikalien oder Medikamenten-Kandidaten) für ihre Wirkung auf Ca^{2 +}test-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma entweder, die potenziellen negativen Auswirkungen auf menschliche Samenzelle Funktion zu untersuchen oder eine mögliche Rolle als Verhütungsmittel zu untersuchen. Hier werden zwei Medium-Durchsatz-Assays beschrieben: (1) ein Fluoreszenz-basierten Test zur Bewertung der Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung in menschliche Spermien und (2) ein Bild durchflusszytometrischen Assay für die Bewertung von Akrosom Reaktion in menschliches Sperma. Diese Tests können verwendet werden, um eine große Anzahl von Verbindungen für Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Bildschirm-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma. Darüber hinaus können die Assays verwendet werden hochspezifische Dosis-Wirkungs-Kurven der einzelnen Verbindungen zu generieren, um festzustellen mögliche Additivität/Synergismus für zwei oder mehr Verbindungen und der pharmakologischen Wirkmechanismus durch wettbewerbsfähige Hemmung zu studieren Experimente mit CatSper-Inhibitoren.

Introduction

Die beiden Assays, die hier beschriebenen soll Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma wie für mehrere Verbindungen in mehreren Publikationen Einsatz dieser assays^{1,2, 3,4,5,6,7}. Ca^{2 +}-Signalisierung und Akrosom Reaktion sind entscheidend für normalen menschlichen Samenzelle Funktion und Fruchtbarkeit des Mannes.

Das übergeordnete Ziel einer menschlichen Samenzelle ist das Ei zu befruchten. Um erfolgreich und natürlich das Ei zu befruchten zu können, müssen die Funktionen der Samenzelle fest während der Fahrt die Samenzelle durch die weiblichen Fortpflanzungsorgane^8,9geregelt werden. Viele der Samenzelle Funktionen unterliegen über die intrazelluläre Ca^{2 +}-Konzentration [Ca^{2 +}]_ich (z. B. Sperma Motilität, Chemotaxis und Akrosom Reaktion)¹⁰. Auch ist ein Reifungsprozess, der Rechtsfähigkeit, die die Samenzellen zur Befruchtung der Eizelle macht, genannt teilweise geregelt [Ca^{2 +}]_ich¹⁰. Ca^{2 +}-Extrudieren Ca^{2 +}-ATPase-Pumpen-¹¹ erhalten ein ca. 20.000 Fach Ca^{2 +}-gradient über die menschlichen Samenzelle Membran mit einer ruhenden [Ca^{2 +}]_ich von 50-100 nM. Wenn Ca^{2 +} erlaubt ist, die Zellmembran zu überqueren (z. B. durch die Öffnung des Ca^{2 +}-Kanäle), ein großer Zustrom von Ca^{2 +} auftritt, was zu einer Höhe von [Ca^{2 +}]_ich. Trägt jedoch auch die Samenzelle intrazellulären Ca^{2 +}-Läden, die Ca^{2 +} freisetzen können und daher auch geben [Ca^{2 +}]_ich¹²Höhe steigen. Interessanterweise alle Kanal-vermittelten Ca^{2 +}-Zustrom in menschliche Samenzellen bisher festgestellt wurde, über CatSper (KatzeIonischen Kanal der SpeRm), auftreten, die nur in Spermien¹¹zum Ausdruck kommt. In menschliche Samenzellen CatSper wird aktiviert durch die endogenen Liganden Progesteron und Prostaglandine durch unterschiedliche Ligand verbindliche Sites^13,14,15, führt zu einer raschen Ca^{2 +}-Zustrom in die Samenzelle. Zwei Quellen in der Nähe von dem Ei bieten hohes Maß an diesen endogenen Liganden. Eine ist die Follikelflüssigkeit, die hohe Konzentrationen von Progesteron¹⁶enthält. Die Follikelflüssigkeit wird aus Reifen Follikeln zusammen mit dem Ei beim Eisprung und vermischt sich mit der Flüssigkeit innerhalb der Eileiter¹⁷freigegeben. Die wichtigste Quelle ist die Cumulus-Zellen, die die Eizelle umgeben und lassen hohe Progesteron und Prostaglandine. Die Progesteron-induzierte Ca^{2 +}-Zustrom in die Samenzellen zu vermitteln Chemotaxis gegenüber Ei^9,18, Steuern Spermien-Motilität^19,20 und stimulieren die Akrosom nachweislich Reaktion²¹. Auslösung von diesen einzelnen [Ca^{2 +}]_ich-regulierten Sperma-Funktionen in der richtigen Reihenfolge und zum richtigen Zeitpunkt ist entscheidend für die Befruchtung der Eizelle⁸. Im Einklang mit dieser, eine suboptimale Progesteron-induzierte Ca^{2 +}-Zustrom zugeordnet werden reduziert männliche Fruchtbarkeit^{22,23,24,25,26 gefunden wurde ,27,28,29} und funktionale CatSper ist unabdingbar für männliche Ergiebigkeit^{26,30,31,32, 33,34,35,36}.

Da die Spermien die Eizelle erreichen, eine Abfolge von Ereignissen erfolgen für die Befruchtung auftreten: (1) die Samenzellen müssen dringen in die umliegenden Cumulus Zellschicht, 2) an die Zona Pellucida binden, (3) den acrosomal Inhalt, die sogenannte Akrosom Reaktion exocytose ³⁷, 4) dringen in die Zona Pellucida und 5) verschmelzen mit der Eihülle Befruchtung³⁸abgeschlossen. Um durch diese Schritte zu gehen und das Ei zu befruchten, müssen die Samenzelle zuerst Rechtsfähigkeit¹¹, unterziehen, die beginnt, wenn die Samenzellen verlassen die Samenflüssigkeit enthält “decapacitating” Faktoren³⁹ und in den Flüssigkeiten des Weibchens schwimmen Fortpflanzungsorgane mit hohen Niveaus von Bikarbonat und Albumin³⁷. Rechtsfähigkeit rendert die Spermien in der Lage, Überaktivierung, eine Form der Motilität mit eine kräftige Tracht Prügel der Geissel und Akrosom Reaktion³⁷zu unterziehen. Überaktivierung Motilität ist erforderlich für die Penetration der Zona Pellucida⁴⁰, und das Akrosom enthält verschiedene hydrolytische Enzyme, die diese Durchdringung Prozess⁴¹Hilfe. Darüber hinaus macht Akrosom Reaktion der Samenzellen in der Lage, der Verschmelzung mit dem Ei, indem man bestimmte Membranproteine auf der Sperma-Oberfläche für Sperma-Ei Fusion⁴²notwendig. Folglich die Fähigkeit Überaktivierung und Akrosom Reaktion zu unterziehen sind sowohl für erfolgreiche Befruchtung der Eizelle^40,42erforderlich. Im Gegensatz zu dem, was für Maus Samenzellen^43,44,45gesehen hat kann nur menschliche Samenzellen, die Akrosom intakt sind an die Zona Pellucida⁴⁶binden. Wenn die menschliche Samenzellen an die Zona Pellucida gebunden sind haben sie unterziehen die Akrosom Reaktion, die Zona Pellucida⁴¹ einzudringen und um bestimmte Membranproteine freizulegen, die für die Verschmelzung mit dem Ei³⁸benötigt werden. Das Timing der Akrosom Reaktion in menschliches Sperma ist somit entscheidend zur Befruchtung auftreten.

Wie oben beschrieben, Ca^{2 +}-Signalisierung ist wichtig für normale Spermien Zelle Funktion⁸, und es daher von großem Interesse ist in der Lage sein eine Bildschirm große Anzahl von Verbindungen für Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung in menschliche Samenzellen. Ebenso wie nur menschliche Samenzellen, die Akrosom Reaktion auf den richtigen Zeitpunkt und Ort unterzogen werden können die Zona Pellucida zu durchdringen und die Eier^{46,47 befruchten}, ist es auch von großem Interesse, Verbindungen für ihre Fähigkeit, testen zu können beeinträchtigen Sie die Akrosom Reaktion in menschliche Spermien. Zu diesem Zweck werden zwei Medium Throughput Screening-Tests beschrieben: (1) ein Test für Wirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung in menschliche Samenzellen und (2) ein Test für die Fähigkeit, Akrosom Reaktion in menschliche Samenzellen zu induzieren.

1-Assay ist ein Medium-Durchsatz Ca^{2 +}-Assay-Signalisierung. Diese Fluoreszenz Platte Leser-basierte Technik überwacht Änderungen in Fluoreszenz als Funktion der Zeit gleichzeitig in mehreren Brunnen. Die Ca^{2 +}-sensible Fluoreszenzfarbstoff, Fluo-4 hat einen K-_d für Ca^{2 +}≈ 335 nM und Zelle-permeationsfähigen in AM (Acetoxymethyl) Ester Form ist. Mit Fluo-4, ist es möglich, Änderungen in [Ca^{2 +}]_i im Laufe der Zeit und nach der Zugabe von Verbindungen des Interesses zu den Samenzellen zu messen. Der Test wurde von im Labor von Timo Strünker 2011¹³ entwickelt und ist seitdem in mehreren Studien zu Bildschirm Verbindungen für Auswirkungen auf Ca^{2 +}benutzt worden-Signalisierung in menschliches Sperma^{1,2,3, 4,5}. Auch hat eine ähnliche Methode verwendet wurde, mehrere Drogen Kandidaten⁴⁸auf den Bildschirm. Dieser Test eignet sich darüber hinaus auch für die Beurteilung des pharmakologischen Modus der Aktion^1,2,3,4,5, Dosis-Wirkungs-Kurven^{1, 2,3,4,5}, wettbewerbsfähige Hemmung^1,2, Additivität^1,2und Synergismus³ Verbindungen des Interesses.

Test 2 ist ein Medium-Durchsatz Akrosom Reaktion Assay. Dieses Bild Cytometer-basierten Methode misst die Menge an lebensfähigen Akrosom reagierte Samenzellen in einer Probe, mit drei fluoreszierende Farbstoffe: Propidium Jodid (PI), FITC gekoppelten Lektin Pisum Sativum (FITC-PSA) und Hoechst 33342. Der Test wurde von einer ähnlichen Flow Cytometry-basierte Methode von Zoppino Et Al.⁴⁹ geändert und wurde in mehreren Studien^6,7verwendet. Für die Ca^{2 +}-Signalisierung Assay, Akrosom Reaktion Assays könnte auch verwendet werden, um die Dosis-Wirkungs-Kurven, Hemmung, Additivität und Synergismus der Verbindungen des Interesses zu beurteilen.

Protocol

Die Sammlung und Analyse von menschlichen Samenproben in den Protokollen folgt den Richtlinien der Forschung-Ethik-Kommission der dänischen Hauptstadt Region. Alle Spermaproben haben freiwillige Spender nach Einwilligung eingeholt. Nach der Geburt wurden die Proben vollständig anonymisiert. Für ihre Unannehmlichkeiten erhielt jeder Spender eine Gebühr von 500 DKK (ca. $75 US-Dollar) pro Probe. Die Proben wurden am Tag der Lieferung analysiert und dann sofort nach den Laborversuchen zerstört. <p class="jove_conte…

Representative Results

Vertreter ergibt sich aus einem Experiment testen die Wirkung von 4 Verbindungen (A, B, C und D) zusammen mit einer positiven (Progesteron) und negativ (Puffer) Kontrolle auf [Ca2 +]i in menschlichem Samen mit der Medium-Durchsatz Ca2 +-Signalisierung Assay sehen in Abbildung 4a. In Abbildung 4 bzeigt eine Dosis-Antwort-Kurve von Progesteron die Spitze ΔF/F0 (%) abgeleitet wurde, Daten…

Discussion

Die mittleren Durchsatz Ca^{2 +} Signalisierung Assay basiert auf Messungen der Fluoreszenz von einzelnen Mikrovertiefungen enthält etwa 250.000 Samenzellen. Das aufgenommene Signal wird von allen einzelnen Samenzellen in den Brunnen gemittelt. Der Test bietet somit, dass keine räumlichen Informationen, wo speziell in der Samenzelle [Ca^{2 +}]_ich geändert wird, wie groß ein Anteil der Spermien, die eine Änderung der [Ca^{2 +}]_i findet, oder wie heterogen ist die Antwort …

Materials

0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer