Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여
Summary
전통적인 cDNA 기반 overexpression 기법 때문에 잠재적인 기능을 가진 그들의 여러 결합 형태 긴 noncoding RNAs의 overexpression에 대 한 제한 적용을 했습니다. 이 리뷰 긴 noncoding RNA의 여러 스플라이스 변종 overexpress CRISPR 기술을 사용 하 여 프로토콜을 보고 합니다.
Abstract
긴 noncoding RNA (lncRNA) 생물학 연구, 2007 년 이후 기 하 급수적으로 성장 하는이 분야에서 간행물의 수의 새롭고 흥미로운 분야 이다. 이러한 연구는 lncRNAs 거의 모든 질병에 변경 되는 것 확인 했습니다. 그러나, 질병의 맥락에서 lncRNAs에 대 한 기능적 역할을 공부 하 고 단백질 제품, 조직의 특정 식, 낮은 식 레벨, 결합 한 형태로, 복잡 한의 부족 종 가운데 보존의 부족으로 어려운 남아 있다. 감안할 때 종의 식, lncRNA 연구는 종종 인간의 연구 컨텍스트 제한 질병 과정 공부를 할 때. LncRNAs는 분자 수준에서 작동, 이므로 lncRNA 생물 해 부 방법 중 하나는 lncRNA를 제거 하거나 overexpress lncRNA 및 측정 세포 효과. 이 문서에서는, 생체 외에서 lncRNAs overexpress을 작성 하 고 시각화 된 프로토콜 제공 됩니다. 대표적인 실험으로는 lncRNA 선 동적인 장 질병, 인터페론 감마 Antisense 1 (IFNG-AS1)와 관련 된 Jurkat T 세포 모델에 overexpressed에 표시 됩니다. 이 위해 활성화 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술은 overexpression 생 게놈 loci에서 사용할 수 있도록 사용 됩니다. 활성화 CRISPR 기술 대상 transcriptional 시작 사이트 여러 lncRNA 결합 형태의 강력한 overexpression를 활성화 한 유전자의 녹음 방송 요인의 집합. 이 절차 3 단계, 즉 (i) 가이드 RNA (gRNA) 디자인 및 벡터 건설, (ii) 바이러스 생성 및 변환, 및 (iii) 식민지 심사 overexpression에 대 한으로 세분화 될 것 이다. 이 대표적인 실험에 대 한 20-fold 향상 IFNG-AS1 Jurkat T 세포에서에서 관찰 되었다 보다는.
Introduction
가장 생물 의학 연구는 단백질 코딩 성적표를 중점적으로, 베낀된 유전자의 대다수는 실제로 noncoding RNAs (합 자료 93)의 구성 됩니다. 현재 연구는 2007 년과 20171사이 기 하 급수적으로 상승 하는 질병 과정에서 lncRNAs에 간행물의 수와 함께이 필드를 탐험 시작 됩니다. 이 간행물은 많은 lncRNAs 질병와 관련 된 보여 줍니다. 그러나,이 lncRNAs의 분자 메커니즘은 mRNAs에 비해 그들의 다양 한 기능으로 인해 공부 하기가 어렵습니다. LncRNAs 질병에서의 역할 이해의 문제를 다중, lncRNAs 주로 코딩 RNAs2보다 하위 수준에 표시 됩니다. 또한, lncRNAs는 가난 하 게 보존, 인간의 세포 라인 기반 기술3기능 연구를 제한 하. 이 비 발한 유전자의 메커니즘을 연구 한 방법은 endogenously 경작된 한 세포에 overexpress 것입니다. Overexpression 학문 특정 한 유전자의 기능으로 중요 한 정보를 제공 하 고 연구원은 주요 분자 경로 해 부를 수 있도록 수 있습니다.
LncRNA 유전자의 전사를 활성화 하는 새로운 방법은 게르 바흐 연구소4에 의해 처음 개발 하는 CRISPR 기술을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 lncRNA 생물학에서 사용 하 고 다른 모델 시스템에서이 유전자의 표현에 대 한 적응 되었습니다. 기술 overexpressing CRISPR에서 CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 이라고 불리는 단백질 Cas9에 의해 인식 되는 센스 gRNA 통해 DNA 시퀀스를 향해 이동 수 있습니다. 일반적으로, Cas9 DNA 분열;을 유발 한다 그러나, Cas9, 이전 overexpression 기술에 대 한 개발에 변이이 단계5를 비활성화 합니다. “죽은” Cas9에 transcriptional 활성 제를 융합 하는 때 (dCas9) 셀 라인으로 불리고, lncRNAs의 생 overexpression 수 달성된4,6. DCas9 유전자 활성화 시스템의 효능을 증가 하는 gRNA, gRNA에 바인딩할 추가 transcriptional 요소 사용에 대 한 추가 수정 추가 사진7. 중요 한 것은, 그것 transcriptional 활성화 근접에서는 시연 했다 (< 200 bp)는 transcriptional 시작 사이트 유전자, 유전자 풍부한 지역7에 특정 upregulation를 사용. CRISPR 녹아웃 기술, 달리 dCas9 및 gRNA 카세트는 여러 세대에 걸쳐 overexpression를 유지 하기 위해 셀 수 있도록 게놈으로 통합 될 필요가 있다. 이를 위해 한 가지 방법은 dCas9 및 gRNA 포함 된 카세트를 통합 lentiviruses를 사용 하는 것입니다. 통합 후 lncRNA 유전자 발현을 확인할 수 있습니다.
이 문서에서는, lncRNA overexpression Jurkat T 세포 모델에 대 한 프로토콜 시연 됩니다. 단계별 절차는 표시 되 고 또한 부착 셀에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 생체 외에서 lncRNAs overexpress를 CRISPR를 활성화 사용 하 여 프로토콜을 선물 한다. 이 긴 noncoding RNAs transcriptomic 제품 기능 단위는 공부를 할 때 특히 중요 한 기술입니다. Overexpression, 후 연구원 수, 다음, 사용 하 여 이러한 셀 바인딩 파트너를 공부를 할 때 신호 대 잡음 비율을 증가 하 여도 세포 lncRNAs의 증가 수준 결과 측정. 또한, lncRNAs 자주 독립-유전자, 행동으로이 생 overexpression 기술을…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.P.는 RO1 DK60729 및 P30 DK 41301-26에 의해 지원 됩니다. D.P.는 크 론 & Colitis 재단 (CCFA) 경력 개발 상, 치료에 의해 지원 됩니다: 소화기 질환 연구 센터 (DDRC) DK41301, 그리고 UCLA 임상 및 변환 과학 연구소 (CTSI) UL1TR0001881. Ucla의 바이러스학 코어로는 센터의 에이즈 연구 (CFAR) 투자 되었다 5 P 30 AI028697를 부여. 핵심 치료/P30에 의해 지원 되었다 UCLA 통합 분자 기술 DK041301를 부여 합니다. 이 작품 또한 UCLA 에이즈 연구소에 의해 지원 되었다.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
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