Transplantation intraventriculaire de précurseurs neuronaux artificiels pour les études de neuroarchitecture In Vivo
Summary
Basée sur l’ingénierie lentivirale in vitro des précurseurs neuronaux, leur co-transplantation dans des cerveaux de type sauvage et l’évaluation morphométrique appariée des dérivés « test » et « contrôle », cette méthode permet une modélisation précise du contrôle des gènes in vivo du néocortical morphologie neuronale d’une manière simple et abordable.
Abstract
Le contrôle génique de la cytoarchitecture neuronale fait actuellement l’objet d’une enquête intensive. Décrit ici est une méthode simple développée pour étudier le contrôle in vivo de gène de la morphologie néocortical de neurone de projection. Cette méthode est basée sur (1) l’ingénierie lentivirale in vitro des précurseurs neuronaux comme cellules « d’essai » et de « contrôle », (2) leur co-transplantation dans les cerveaux sauvages-type, et (3) l’évaluation morphométrique paire de leurs dérivés neuronaux. Plus précisément, des précurseurs pallial E12.5 provenant de donneurs panneuronaux, génétiquement étiquetés, sont utilisés à cette fin. Ils sont conçus pour tirer parti de certains promoteurs et de la technologie tetON/OFF, et ils sont transplantés à la main libre dans des ventricules latéraux néonatals. Plus tard, sur le profilage d’immunofluorescence des cerveaux receveurs, des silhouettes des neurones transplantés sont introduites dans le logiciel open source NeurphologyJ, leurs paramètres morphométriques sont extraits, et la longueur moyenne et l’index de ramification sont calculés. Comparé à d’autres méthodes, celle-ci offre trois avantages principaux : elle permet la réalisation d’un contrôle fin de l’expression transgène à des coûts abordables, elle ne nécessite que des compétences chirurgicales de base, et elle fournit des résultats statistiquement fiables sur analyse d’une nombre d’animaux. En raison de sa conception, cependant, il n’est pas suffisant pour aborder le contrôle non cellulaire-autonome de la neuroarchitecture. En outre, il devrait être de préférence employé pour étudier le contrôle de morphologie neurite après l’achèvement de la migration neuronale. Dans sa formulation actuelle, cette méthode est exquisement accordée pour étudier le contrôle génique de l’architecture néocortical de neurone glutamatergic. Profitant des lignées transgéniques exprimant l’EGFP dans d’autres types spécifiques de cellules neurales, il peut être réconçu pour aborder le contrôle génétique de leur architecture.
Introduction
Ici nous décrivons une méthode simple que nous avons développée pour disséquer le contrôle in vivo de gène de cytoarchitecture neuronale. Basé sur l’ingénierie in vitro des précurseurs neuronaux, leur transplantation dans le cerveau néonatal et l’évaluation morphométrique couplée des cellules « d’essai » et de « contrôle », il permet de dévoiler des implications fonctionnelles des gènes de test dans le contrôle fin de la morphologie neuronale dans un moyen rapide et abordable. Pour étudier le contrôle in vivo des gènes de l’architecture neuronale, trois questions techniques clés doivent être abordées : (1) la réalisation d’une expression de gène d’intérêt (GOI) correctement modelée et un contrôle quantitatif précis de celui-ci; (2) obtenir une visualisation correctement segmentée des silhouettes neuronales distinctes; (3) obtenir une signification statistique des résultats tout en employant un nombre limité d’animaux.
Lorsqu’elles sont disponibles, les lignées mutantes de souris abritant des transgènes contrôlés par la tétracycline (tet) peuvent être le meilleur outil pour aborder le premier numéro1. Alternativement, la transgenèse somatique peut être employée. Dans de tels cas, le transgène est délivré par électroporation2 ou transduction virale3. Ensuite, il est conservé comme épisome (par exemple, lors de l’électroporation standard4), ou il est intégré dans le génome (au hasard, via l’intégrase rétrovirale5;ou dans un endroit défini, via CRISPR-promouvoir recombinaison homologue (SLENDR)6 ).
Deuxièmement, la visualisation neuronale de la silhouette peut être réalisée par (a) l’étiquetage uniforme clairsemé ou (b) l’étiquetage différentiel dense. En ce qui concerne l’étiquetage clairsemé, des méthodologies avancées de golgi peuvent être employées7, certains minisets neuronaux peuvent être remplis par la biocytine8, et l’étiquetage sel et poivre peut être obtenu grâce à un transgène peu exprimé. Un tel transgène peut afficher une transcription variée (Thy-EGFP)9 ou peut être activé par recombinaison stochastique (MORF)10. En ce qui concerne (b), les stratégies de pointe comprennent la recombinaison stochastique à médiation C au sein d’un réseau de transgènes de fluoroprotéines multi-floxed (Brainbow)11, ainsi que l’intégration génomique de gènes fluoroprotéines par la transpolation de piggyBac-transposase, précédemment par transgenèse somatique (CLoNE)12.
En ce qui concerne le troisième problème, le résultat morphométrique est souvent affecté par une grande variabilité aléatoire, provenant de différences inter-animaux et les contingences d’injection cellulaire. Pour cette raison, un grand nombre d’animaux est généralement utilisé pour atteindre la puissance statistique nécessaire pour évaluer l’activité morphométrique GOI.
Les approches décrites précédemment reposent souvent sur des compétences techniques avancées et nécessitent des ressources financières remarquables, ce qui peut limiter leur diffusion au sein de la communauté scientifique. Pour contourner ces problèmes, nous avons conçu un pipeline simple et facile pour disséquer le contrôle génétique de la neuroarchitecture in vivo d’une manière rapide et abordable. Ceci est inspiré par une conception similaire de co-transplantation précédemment développée pour l’évaluation in vivo rapide de l’activité de transgène antiblastique13.
Plus précisément, on pense que la co-transplantation de précurseurs neuronaux « verts » in vitro (« cellules de test » et de « contrôle ») dans un cerveau néonatal « noir » peut simultanément corriger les trois questions clés énumérées ci-dessus. En fait, l’ingénierie lentivirale in vitro de précurseurs, dans des conditions bien contrôlées, permet le maintien de la variabilité de l’expression transgène neuronale au minimum, bien en dessous de celle habituellement associée à des manipulations somatiques in vivo (effectuées précédemment 14 (en) , 15 et dans nos résultats inédits). Le contrôle précis de l’expression des gènes qui en résulte est comparable à celui obtenu par des modèles transgéniques contrôlés par les tets. Cependant, les coûts de cette procédure sont bien inférieurs à ceux provenant de l’entretien d’une ligne de souris transgénique. Ensuite, l’injection de cellules à main levée est facile et nécessite une formation minimale. En outre, la quantité de précurseurs étiquetés injectés dans chaque cerveau peut être facilement réglée pour atteindre un nombre cumulatif suffisant de précurseurs peu distribués, tout en maintenant le nombre total d’animaux transplantés à un minimum. Enfin, la co-injection de précurseurs pseudoo-étiquetés différemment, « testés » et « témoins » et l’analyse statistique par paire s’ensuit des résultats contrecarrent les effets de la variabilité expérimentale interanimale, permettant d’atteindre l’importance statistique des résultats, même sur l’analyse d’un nombre limité d’individus13.
Il convient de souligner que, bien que rapide et bon marché, cette méthode a deux principales limites. Tout d’abord, il est conçu pour étudier le contrôle des gènes autonomes cellulaires de l’architecture neuronale, et il n’est pas approprié de s’attaquer au contrôle de l’environnement. Deuxièmement, comme les précurseurs neuronaux transplantés atteignent leur emplacement final par un calendrier hétérochronique, cette méthode est préférable au contrôle neuroarchitectonique modèle se produisant après l’achèvement de migration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les aspects/étapes spécifiques de cette procédure sont essentiels et nécessitent une attention particulière. Premièrement, a) les opérateurs doivent être suffisamment préformés pour manipuler en toute sécurité les lentivirus dans un environnement de laboratoire conforme au BSL-2. Deuxièmement, b) avant de mélanger les préparations neuronales « test » et « contrôle », il est obligatoire de laver soigneusement les deux suspensions de neurosphère correspondantes telles que décrites, afin d’éviter tout…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mihn Duc Do pour sa contribution à la mise en place précoce de cette procédure.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. . Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- . . NeurphologyJ Manual. , (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
