Intraventricular transplantasjon av konstruerte neuronal forløpere for in vivo Neuroarchitecture studier
Summary
Basert på in vitro lentiviral engineering av neuronal forløpere, deres co-transplantasjon i vill-type hjerner og sammenkoblet morphometric evaluering av “test” og “kontroll” derivater, gir denne metoden nøyaktig modellering av in vivo gen kontroll av neocortical Nevron morfologi på en enkel og rimelig måte.
Abstract
Gene kontroll av neuronal cytoarchitecture er i dag gjenstand for intensiv etterforskning. Beskrevet her er en enkel metode utviklet for å studere in vivo gen kontroll av neocortical projeksjon Nevron morfologi. Denne metoden er basert på (1) in vitro lentiviral engineering av neuronal forløpere som “test” og “kontroll” celler, (2) deres co-transplantasjon i vill-type hjerner, og (3) sammenkoblet morphometric evaluering av deres neuronal derivater. Nærmere bestemt, E 12.5 pallial forløpere fra panneuronal, genetisk merket givere, er ansatt for dette formålet. De er konstruert for å dra nytte av utvalgte arrangører og tetON/OFF-teknologi, og de er fri hånds transplantert inn nyfødte lateral ventriklene. Senere, upon immunofluorescence profilering av mottakerens hjerner, silhuetter av transplanterte neurons er matet inn NeurphologyJ åpen kildekode programvare, deres morphometric parametrene er ekstrahert, og gjennomsnittlig lengde og forgrening indeksen er beregnet. Sammenlignet med andre metoder, gir denne en tre viktigste fordeler: det tillater å oppnå fin kontroll av transgene uttrykk til rimelige kostnader, det krever bare grunnleggende kirurgiske ferdigheter, og det gir statistisk pålitelige resultater på analyse av en begrenset antall dyr. På grunn av sin design, men er det ikke tilstrekkelig å ta ikke celle-autonome kontroll av neuroarchitecture. Videre bør det fortrinnsvis brukes til å undersøke neurite morfologi kontroll etter fullføring av neuronal migrasjon. I sin nåværende formulering, er denne metoden utsøkt innstilt til å undersøke gen kontroll av glutamatergic neocortical Nevron arkitektur. Dra nytte av transgene Lines uttrykke EGFP i andre spesifikke nevrale celletyper, kan det bli re-purposed å ta gen kontroll over sin arkitektur.
Introduction
Her beskriver vi en enkel metode vi utviklet for å analysere in vivo gen kontroll av neuronal cytoarchitecture. Basert på in vitro engineering av neuronal forløpere, deres transplantasjon til nyfødte hjernen og sammenkoblet morphometric evaluering av “test” og “kontroll” celler, det gjør det mulig å avsløre funksjonelle implikasjoner av test gener i fin kontroll av neuronal morfologi i en rask og rimelig måte. For å undersøke i vivo gen kontroll av neuronal arkitektur må tre viktige tekniske spørsmål tas opp: (1) oppnå et tilstrekkelig mønstret gen-av-interesse-uttrykk (GOI) og en nøyaktig kvantitativ kontroll av det; (2) få en riktig segmentert visualisering av distinkte neuronal silhuetter; (3) fremlokkende statistiske betydningen av resultater mens ansette et begrenset antall dyr.
Når tilgjengelig, mus mutant linjer harboring Tetracycline (tet)-kontrollerte transgenes kan være det beste verktøyet for å løse den første utgaven1. Alternativt kan somatiske transgenesis være ansatt. I slike tilfeller leveres transgene via electroporation2 eller viral Transduction3. Neste, det er beholdt som en episome (f. eks, ved standard electroporation4), eller det er integrert i Genova (tilfeldig, via retroviral integrase5; eller i en definert plassering, via CRISPR-FORFREMMET homologe rekombinasjon (SLENDR)6 ).
For det andre kan neuronal silhuett visualisering oppnås via (a) sparsom uniform merking eller (b) tett differensial merking. Som for sparsom merking, avanserte Golgi-lignende metoder kan være ansatt7, utvalgte neuronal minisets kan fylles av biocytin8, og salt-og-pepper merking kan fås takket være et tynt uttrykt transgene. En slik transgene kan vise spraglete transkripsjon (Thy-EGFP)9 eller kan aktiveres av Stokastisk REKOMBINASJON (MORF)10. Som for (b), State of Art strategier inkluderer grobunn-mediert Stokastisk rekombinasjon innenfor en multi-floxed fluoroprotein transgene array (Brainbow)11, samt piggyBac-transposase-drevet genomisk integrering av fluoroprotein gener, tidligere leveres via somatiske transgenesis (klone)12.
Som for det tredje problemet, er morphometric utfallet ofte påvirket av en stor tilfeldig variasjon, som stammer fra Inter-dyr forskjeller og celle-injeksjon situasjoner. På grunn av dette, er et stort antall dyr vanligvis brukt for å oppnå den statistiske kraften som er nødvendig for å vurdere GOI morphometric aktivitet.
Tilnærminger tidligere beskrevet ofte stole på avanserte tekniske ferdigheter og krever iøynefallende økonomiske ressurser, som kan begrense deres diffusjon i det vitenskapelige samfunnet. For å omgå disse problemene, har vi unnfanget en enkel og grei rørledning å analysere gen kontroll av neuroarchitecture in vivo på en rask og rimelig måte. Dette er inspirert av en lignende co-transplantasjon design tidligere utviklet for rask in vivo evaluering av antiblastic transgene aktivitet13.
Nærmere bestemt er det antatt at co-transplantasjon av in vitro konstruert “grønne” nevrale forløpere (“test” og “kontroll” celler) til en “svart” mottaker nyfødt hjernen kan samtidig fikse de tre sentrale spørsmålene nevnt ovenfor. Faktisk, in vitro lentiviral engineering av forløpere, i godt kontrollerte forhold, tillater vedlikehold av variasjon av neuronal transgene uttrykk på et minimum, langt under som vanligvis forbindes med in vivo somatiske manipulasjoner (utført tidligere 14 priser og priser , 15 og i våre upubliserte resultater). Den resulterende nøyaktig kontroll av genuttrykk er sammenlignbar med det som oppnås ved tet-kontrollerte transgene modeller. Men kostnadene ved denne prosedyren er langt under de som kommer fra vedlikehold av en transgene muse linje. Neste, fri hånds celle injeksjon er enkel og krever minimal trening. Videre kan mengden av navngitte prekursorer injiseres i hver hjerne enkelt stilles inn for å oppnå et tilstrekkelig kumulativ antall av tynt fordelte forløpere, samtidig som det totale antallet transplanterte dyr på et minimum. Sist men ikke minst, co-injeksjon av forskjellig fluoro-merket, “test” og “kontroll” forløpere og påfølgende parvis statistisk analyse av resultatene motvirke virkningene av Inter-dyr eksperimentell variasjon, slik at det å nå Statistisk betydning av resultatene, selv ved analyse av et begrenset antall individer13.
Det bør understrekes at, riktignok rask og billig, har denne metoden to hoved begrensninger. For det første er det designet for å undersøke celle-autonome gen kontroll av neuronal arkitektur, og det er ikke hensiktsmessig å ta miljøkontroll. For det andre, som transplantert neuronal prekursorer nå sitt endelige sted ved en heterochronic tidsplan, er denne metoden å foretrekke å modellere neuroarchitectonics kontroll oppstår tidligere migrering ferdigstillelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spesifikke aspekter/trinn i denne prosedyren er kritiske og krever spesiell oppmerksomhet. Først (a) operatørene må være tilstrekkelig pretrained å trygt manipulere lentiviruses i en BSL-2 kompatibel lab miljø. For det andre, (b) før blande “test” og “kontroll” neural preparater, er det obligatorisk å nøye vaske de to tilsvarende neurosphere suspensjoner som beskrevet, for å hindre eventuelle forsinket kryss-smitte av de to forberedelsene på grunn av uønskede lentiviral bære over. For det tredje, (c) mens tr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mihn Duc do for hans bidrag til tidlig oppsett av denne prosedyren.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. . Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- . . NeurphologyJ Manual. , (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
