Intraventrikulær transplantation af konstruerede neuronal prækursorer til in vivo Neuroarchitecture studier
Summary
Baseret på in vitro lentiviral engineering af neuronal prækursorer, deres Co-transplantation til vild-type hjerner og parret morphometrisk evaluering af “test” og “kontrol” derivater, denne metode giver præcis modellering af in vivo gen kontrol af neocortical neuron morfologi på en enkel og overkommelig måde.
Abstract
Genkontrol af neuronal cytoarchitecture er i øjeblikket genstand for intensiv efterforskning. Beskrevet her er en simpel metode udviklet til at studere in vivo gen kontrol af neocortical projektion neuron morfologi. Denne metode er baseret på (1) in vitro lentiviral engineering af neuronal prækursorer som “test” og “kontrol” celler, (2) deres medtransplantation til vild-type hjerner, og (3) parret morfometrisk vurdering af deres neuronal derivater. Specifikt, E 12.5 pallial prækursorer fra panneuronal, genetisk mærkede donorer, er ansat til dette formål. De er konstrueret til at drage fordel af udvalgte promotorer og tetON/OFF-teknologi, og de er frihånds planteret til neonatal laterale ventrikler. Senere, efter immunofluorescens profilering af modtager hjerner, silhuetter af transplanterede neuroner er fodret med NeurphologyJ open source-software, deres morphometriske parametre udvindes, og gennemsnitlig længde og forgrenings indeks beregnes. Sammenlignet med andre metoder, denne ene giver tre vigtigste fordele: det giver mulighed for at opnå en fin kontrol af transgene ekspression til overkommelige omkostninger, det kræver kun grundlæggende kirurgiske færdigheder, og det giver statistisk pålidelige resultater ved analyse af en begrænset antal dyr. På grund af sit design, dog, det er ikke tilstrækkeligt til at løse ikke-celle-autonome kontrol af neuroarchitecture. Desuden bør det fortrinsvis anvendes til at undersøge neurite morfologi kontrol efter afslutning af neuronal migration. I sin nuværende formulering, denne metode er udsøgt tunet til at undersøge genkontrol af glutamaterge neortikale neuron arkitektur. Ved at drage fordel af transgene linjer, der udtrykker EGFP i andre specifikke neurale celletyper, kan det genbruges til at adressere genkontrol af deres arkitektur.
Introduction
Her beskriver vi en simpel metode, vi udviklede til at dissekere in vivo gen kontrol af neuronal cytoarchitecture. Baseret på in vitro-engineering af neuronal prækursorer, deres transplantation i neonatal hjerne og parret morfometrisk evaluering af “test” og “kontrol” celler, det gør det muligt at afsløre funktionelle konsekvenser af test gener i fin kontrol af neuronal morfologi i en hurtig og overkommelig måde. For at undersøge in vivo-genkontrol af neuronal arkitektur skal der tages fat på tre centrale tekniske spørgsmål: (1) opnåelse af et tilstrækkeligt mønstret udtryk for gen-of-Interest (GOI) og en nøjagtig kvantitativ kontrol af det; (2) opnåelse af en korrekt segmenteret visualisering af særskilte neuronal silhuetter; (3) fremkalde Statistisk signifikans af resultater, mens der anvendes et begrænset antal dyr.
Når de er tilgængelige, kan mus mutant linjer husly tetracyclin (tet)-kontrollerede transgener være det bedste værktøj til at løse det første spørgsmål1. Alternativt kan der anvendes somatisk transgenese. I sådanne tilfælde leveres transgenet via elektroporation2 eller viral transduktion3. Dernæst bevares det som et episome (f. eks. ved standard elektroporation4), eller det er integreret i genomet (tilfældigt, via antiretroviral integrasehæmmer5; eller på et defineret sted via crispr-forfremmet homologe rekombination (slendr)6 ).
Anden, neuronal silhuet visualisering kan opnås via (a) sparsomme ensartet mærkning eller (b) tætte differentiel mærkning. Med hensyn til sparsomme mærkning, avancerede Golgi-lignende metoder kan anvendes7, udvalgte neuronal minisets kan fyldes med biocytinel8, og salt-og-peber mærkning kan opnås takket være en tyndt udtrykt transgen. En sådan transgene kan vise variegeret transkriptionen (Thy-EGFP)9 eller kan aktiveres ved stokastiske rekombination (morf)10. Med hensyn til (b), state of art strategier omfatter CRE-medieret stokastiske rekombination inden for en multi-floxed fluoroprotein transgene array (Brainbow)11, samt piggyBac-transposase-drevet genomisk integration af fluoroprotein gener, tidligere leveres via somatisk transgenese (klon)12.
Med hensyn til det tredje spørgsmål påvirkes det morphometriske resultat ofte af en stor tilfældig variation, der stammer fra forskelle mellem dyr og celle Indsprøjtnings uforudsete hændelser. Derfor anvendes et stort antal dyr sædvanligvis til at opnå den statistiske effekt, der er nødvendig for at vurdere den indiske morphometriske aktivitet.
De tidligere beskrevne tilgange beror ofte på avancerede tekniske færdigheder og kræver iøjnefaldende finansielle ressourcer, hvilket kan begrænse deres udbredelse inden for forskersamfundet. For at omgå disse problemer, vi udtænkt en nem og ligetil pipeline til at dissekere gen kontrol af neuroarchitecture in vivo på en hurtig og overkommelig måde. Dette er inspireret af en lignende Co-transplantation design tidligere udviklet til hurtig in vivo evaluering af antiblastic transgene aktivitet13.
Specifikt, det menes, at medtransplantation af in vitro manipuleret “grønne” neurale prækursorer (“test” og “kontrol” celler) i en “sort” modtager neonatal hjerne kan samtidig løse de tre centrale spørgsmål, der er anført ovenfor. I virkeligheden, in vitro lentiviral engineering af prækursorer, i velkontrollerede forhold, tillader vedligeholdelse af variabilitet af neuronal transgene udtryk på et minimum, langt under, at der normalt er forbundet med in vivo somatiske manipulationer (udført tidligere 14 , 15 og i vores ikke offentliggjorte resultater). Den resulterende nøjagtige kontrol af genekspression er sammenlignelig med den, der opnås ved tet-kontrollerede transgene modeller. Omkostningerne ved denne procedure er dog langt under dem, der stammer fra vedligeholdelsen af en transgene muse linje. Næste, fri-hånd celle injektion er let og kræver minimal træning. Desuden kan mængden af mærkede prækursorer, der injiceres i hver hjerne, let justeres for at opnå et tilstrækkeligt kumulativt antal tyndt fordelte prækursorer, samtidig med at det samlede antal transplanterede dyr holdes på et minimum. Sidst, men ikke mindst, modvirker Co-injektion af forskellige fluor-mærkede, “test” og “kontrol” prækursorer og efterfølgende parvis statistisk analyse af resultaterne virkningerne af interdyrs eksperimentelle variabilitet, hvilket gør det muligt at nå Statistisk signifikans af resultater, selv ved analyse af et begrænset antal personer13.
Det skal understreges, at, omend hurtig og billig, denne metode har to hovedbegrænsninger. For det første er det designet til at undersøge celle-autonome gen kontrol af neuronal arkitektur, og det er ikke hensigtsmæssigt at behandle miljøkontrol. For det andet, som transplanterede neuronal prækursorer nå deres endelige placering af en heterokronisk tidsplan, denne metode er at foretrække frem for model neuroarchitectonics kontrol sker tidligere migration færdiggørelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Specifikke aspekter/trin i denne procedure er kritiske og kræver særlig opmærksomhed. Først, (a) operatørerne skal være tilstrækkeligt foruddannet til sikkert at manipulere lentivira i et BSL-2-kompatibelt lab miljø. For det andet, (b) før mix “test” og “Control” neurale præparater, er det obligatorisk at omhyggeligt vaske de to tilsvarende Neuro Sphere suspensioner som beskrevet, for at forhindre enhver forsinket krydsinfektion af de to præparater på grund af uønskede lentiviral overføre. For det tredje, (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mihn Duc for hans bidrag til en hurtig indførelse af denne procedure.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. . Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- . . NeurphologyJ Manual. , (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
