الشلل الناجم عن السباحة "تقييم إشارات الدوبامين" في ايليجانس كاينورهابديتيس
Summary
السباحة التي يسببها الشلل (سويب) مقايسة سلوكية راسخة المستخدمة لدراسة الآليات الكامنة الدوبامين إشارات في ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس). ومع ذلك، تفتقر إلى طريقة مفصلة للقيام التحليل. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة سويب.
Abstract
مقايسة السباحة الموصوفة في هذا البروتوكول هو أداة صالحة لتحديد البروتينات التي تنظم تتميز synapses. مماثلة للثدييات، الدوبامين (DA) يتحكم في عدة مهام في C. ايليجانس بما في ذلك النشاط الحركي والتعلم. الظروف التي تحفز دا الإصدار (مثلاً، علاجات المنشطات (أمف)) أو التي تمنع إزالة دا (مثل الحيوانات التي تفتقر إلى الناقل دا (دات-1) التي هي غير قادرة على ريككومولاتينج دا إلى الخلايا العصبية) توليد فائض في دا خارج الخلية وفي نهاية المطاف أدى إلى تحول دون تنقل. هذا السلوك واضح بصورة خاصة عند الحيوانات تسبح في المياه. في الواقع، بينما لا تزال الحيوانات البرية من نوع السباحة لفترة ممتدة، طفرات فارغة دات-1 والبرية من نوع تعامل مع أمف أو مثبطات للناقل دا تنزل إلى أسفل البئر ولا تتحرك. ويطلق على هذا السلوك “الشلل الناجم عن السباحة” (سويب). على الرغم من أن التحليل سويب بشكل جيد، تفتقر إلى وصف مفصل للأسلوب. وهنا يصف لنا دليل خطوة بخطوة لتنفيذ سويب. للقيام التحليل، توضع أواخر الحيوانات 4 مرحلة اليرقات في صفيحة بقعة زجاج الذي يحتوي على محلول السكروز التحكم مع أو بدون أمف. وسجل الحيوانات لسلوكهم السباحة أما يدوياً بواسطة التصور تحت ستيريوسكوبي أو تلقائياً بتسجيل مع كاميرا محمولة على ستيريوسكوبي. ويتم تحليل أشرطة الفيديو ثم استخدام برنامج تعقب، الذي يعطي تمثيل مرئي لسحق التردد والشلل في شكل خرائط الحرارة. ضمان قراءات يمكن قياسها بسهولة من السباحة قدرة الحيوانات النظامين اليدوي والآلي ومما يسهل الفرز للحيوانات إذ تضع الطفرات داخل منظومة تتميز أو للجينات مساعدة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام سويب لتوضيح إليه العمل من المخدرات لتعاطي مثل أمف.
Introduction
الحيوانات أداء مجموعة متنوعة من السلوكيات الفطرية والمعقدة التي هي توسط العصبية المختلفة في تنسيق عمليات إرسال الإشارات معقدة. الناقل العصبي الدوبامين (DA) يتوسط السلوكيات العالية حافظ عبر الأنواع، بما في ذلك التعلم ووظيفة الحركة وتجهيز مكافأة.
ديدان أسطوانية التربة C. ايليجانس، مع نظام عصبي بسيط نسبيا وكذلك معين يتكون من 302 فقط من الخلايا العصبية، يبين السلوكيات ملحوظ المعقدة، بما في ذلك العديد من التي ينظمها دا مثل التزاوج، والتعلم، والمؤن، والحركة ووضع البيض 1-من بين الميزات الأخرى، دورة حياة قصيرة، وسهولة المناولة والحفاظ على إشارات الجزيئات، تسليط الضوء على مزايا استخدام C. ايليجانس كنموذج لدراسة العصبية أساس السلوكيات مصانة.
خنثي C. ايليجانس يحتوي على ثمانية تتميز الخلايا العصبية؛ وبالإضافة إلى ذلك، يتضمن الذكور ستة أزواج إضافية لأغراض التزاوج. كما هو الحال في الثدييات، وتوليف دا هذه الخلايا العصبية والتعبير عن الناقل دا (دات-1)، بروتين غشائي موجودة حصرا في تتميز الخلايا العصبية، الذي ينقل دا صدر في المشقوق متشابك العودة إلى الخلايا العصبية تتميز. وعلاوة على ذلك، معظم البروتينات المشاركة في كل خطوة من التوليف والتعبئة والتغليف والإفراج عن دا هي المحافظة جداً بين البشر والديدان، ومثل في الثدييات، دا ينظم سلوكيات التغذية والحركة في ايليجانس جيم-2.
C. ايليجانس يزحف على السطوح الصلبة وتسبح مع سلوك سحق مميزة في المياه. من المثير للاهتمام، طفرات تفتقر إلى التعبير عن دات-1 (دات-1) الزحف عادة على سطح صلب، لكنهم فشلوا في الحفاظ على السباحة عندما مغمورة بالمياه. ووصف هذا السلوك كان الشلل الناجم عن السباحة، أو سويب. التجارب السابقة أثبتت أن سويب، جزئيا، ناجم عن وجود فائض دا في المشقوق متشابك التي أوفيرستيمولاتيس في نهاية المطاف مستقبلات D2 مثل بوستسينابتيك (DOP-3). على الرغم من أن المحددة أصلاً في دات-1 خروج المغلوب الحيوانات3، سويب ويلاحظ أيضا في الحيوانات البرية من نوع التعامل مع المخدرات أن كتلة النشاط دات (مثلاً، إيميبرامين4) و/أو حمل الإصدار دا (مثل الأمفيتامين5). من ناحية أخرى، منع التلاعب دوائية أو الجينية تجنب التوليف والإفراج عن دا وحظر إعلان المبادئ-3 وظيفة مستقبلات سويب6. أخذت معا، وهذه البيانات المنشورة بالفعل أنشأت سويب كأداة موثوقة دراسة الآثار السلوكية الناتجة عن البروتينات تحور داخل تتميز نهايات3،،من47 والتي ستستخدم شاشات الجينية إلى الأمام لتحديد مسارات تنظيمية رواية المتورطين في دا مما يشير إلى7،،من89،10،،من1112. بالإضافة إلى ذلك، من خلال توفير قراءات يمكن قياسها بسهولة من السلوك الناجم عن المخدرات في الحيوانات الحية، سويب يتيح توضيح آليات عمل الأدوية مثل الأمفيتامين (أمف) وأزابيروني في تتميز سينابسيس5، 6 , 13 , 14 , 15.
وقد وصف بروتوكولات لإجراء فحوصات سويب قبل16. هنا، نحن تصف بالتفصيل المنهجية والإعداد لإجراء التحليل بهدف توفير دليل مرئي للمجتمع C. ايليجانس لفعالية أداء سويب.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة للقيام تحليل السلوكي، سويب، في C. ايليجانس. هذا البروتوكول بسيط ومباشر مع لا عقبات فنية رئيسية مما يجعل هذا الفحص المستخدم جداً ودية. ومع ذلك، هناك بعض الجوانب الهامة التي تحتاج إلى النظر فيها من أجل القيام بفعالية المقايسة.
وينبغي ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر الدكتور أسامة الرفاعي من مختبر الدكتور راندي بلاكلي للتوجيه مع تحليل الآلي سويب. هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة R01 DA042156 إلى LC.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
