Zwemmen geïnduceerde verlamming te beoordelen Dopamine signalering in Caenorhabditis elegans
Summary
Zwemmen geïnduceerde verlamming (SWIP) is een gevestigde gedrags test gebruikt bij het bestuderen van de onderliggende mechanismen van dopamine signalering in Caenorhabditis elegans (C. elegans). Een gedetailleerde methode voor het uitvoeren van de bepaling ontbreekt echter. Hier beschrijven we een stapsgewijze protocol voor SWIP.
Abstract
De bepaling van de zwemmen beschreven in dit protocol is een geldig instrument om te identificeren eiwitten reguleren van de Dopaminerge synapses. Net als bij zoogdieren, dopamine (DA) bepaalt verscheidene functies in C. elegans met inbegrip van leren en motorische activiteit. Voorwaarden die stimuleren DA vrijkomen (bijvoorbeeld amfetamine (AMPH) behandelingen) of die voorkomen DA klaring (bijvoorbeeld dieren ontbreekt de DA vervoerder (dat-1) die zijn niet in staat van DA reaccumulating in de neuronen) genereren van een overmaat van extracellulaire DA wat uiteindelijk resulteert in geremde motoriek. Dit probleem is vooral duidelijk wanneer dieren in water zwemmen. In feite, terwijl de wild-type dieren blijven om te zwemmen voor een langere periode, dat-1 null mutanten en wild-type behandeld met AMPH of remmers van de DA vervoerder zinken naar de bodem van de put en niet verplaatst. Dit gedrag heet “Zwemmen geïnduceerde verlamming” (SWIP). Hoewel de bepaling SWIP goed ingeburgerd is, ontbreekt een gedetailleerde beschrijving van de methode. Hier beschrijven we een stapsgewijze handleiding voor het uitvoeren van SWIP. Voor het uitvoeren van de bepaling, worden laat larvale stadium-4 dieren geplaatst in een plek glasplaat met sacharose bedieningsoplossing met of zonder AMPH. Dieren worden gescoord voor hun zwemmen gedrag of handmatig door visualisatie onder een stereoscoop automatisch door opname met een camera gemonteerd op de stereoscoop. Video’s worden vervolgens geanalyseerd met behulp van een tracking-software, die een visuele weergave van pak slaag frequentie en verlamming in de vorm van warmte kaarten levert. Zowel de handmatige en geautomatiseerde systemen garanderen een gemakkelijk meetbare uitlezing van de dieren zwemmen vermogen en aldus vergemakkelijken screening voor vaneenkeurmerkzijnvoorzien mutaties binnen het Dopaminerge systeem of voor ondersteunende genen. Daarnaast kan de SWIP ophelderen van het werkingsmechanisme van drugs misbruik zoals AMPH worden gebruikt.
Introduction
Dieren te vervullen, een verscheidenheid van aangeboren en complexe problemen die worden bemiddeld door verschillende neurotransmitters gecoördineerd door ingewikkelde signalering processen. De neurotransmitter dopamine (DA) bemiddelt zeer geconserveerde gedrag over soorten, waaronder learning, motor functie en verwerking van beloning.
De bodem nematode C. elegans, met een relatief eenvoudige en goed toegewezen zenuwstelsel bestaande uit alleen 302 neuronen, toont duidelijk complexe gedrag, waaronder vele die zijn geregeld bij DA zoals paring, leren, foerageren, motoriek en leggen van eieren 1. Markeer onder andere functies, korte levenscyclus, gebruiksgemak en de instandhouding van de signalering van moleculen, de voordelen van het gebruik van C. elegans als een model voor het bestuderen van de neurale basis van geconserveerde gedrag.
De hermafrodiet C. elegans bevat acht Dopaminerge neuronen; Naast deze bevat de man zes extra paren voor paring doeleinden. Zoals bij zoogdieren, deze neuronen DA synthetiseren en express de DA transporter (DAT-1), een membraan eiwit gevonden uitsluitend in Dopaminerge neuronen, waarvan transports DA vrijkomen in de synaptische gespleten terug de Dopaminerge neuronen. Bovendien, de meeste van de eiwitten die betrokken zijn bij elke stap van synthese, de verpakking en de release van DA zijn zeer bewaard tussen wormen en mens en zoals bij zoogdieren, DA moduleert voeding gedrag en motoriek in C. elegans2.
C. elegans doorzoekt op vaste oppervlakken en zwemt met een karakteristieke pak slaag gedrag in water. Interessant, mutanten expressie voor DAT-1 (dat-1) ontbreekt normaal kruipen op harde ondergrond maar niet zwemmen wanneer ondergedompeld in water te houden. Dit probleem was zwemmen geïnduceerde verlamming of SWIP genoemd. Eerdere experimenten aangetoond dat SWIP, gedeeltelijk wordt veroorzaakt door een overmaat aan DA in de synaptische spleet die uiteindelijk overstimulates de D2-achtige postsynaptisch receptoren (DOP-3). Hoewel oorspronkelijk geïdentificeerd in dat-1 knockout dieren3, SWIP is ook waargenomen in het wild-type dieren behandeld met medicijnen die de activiteit blok DAT (bijvoorbeeld imipramine4) en/of induceren DA release (bijvoorbeeld amfetamine5). Aan de andere kant, voorkomen farmacologische of genetische manipulaties afwenden van synthese en release van DA en het blokkeren van DOP-3 receptor functie SWIP6. Samen hebben deze reeds gepubliceerde gegevens SWIP opgericht als een betrouwbaar hulpmiddel te bestuderen van de gedragsmatige gevolgen veroorzaakt door gemuteerde eiwitten binnen Dopaminerge synapsen3,4,7 en kunnen worden ingezet voor voorwaartse genetische schermen voor de identificatie van nieuwe regelgevende trajecten die betrokken zijn bij DA signalering7,8,9,10,11,12. Bovendien, door het verstrekken van een gemakkelijk meetbare uitlezing van drug-geïnduceerde gedrag in levende dieren, SWIP maakt het ontrafelen van de mechanismen van de actie van drugs zoals amfetamine (AMPH) en azaperone op de Dopaminerge synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocollen voor het uitvoeren van de tests SWIP zijn vóór16beschreven. Hier beschrijven we in detail de methodologie en de setup voor het uitvoeren van de test met het doel van het verstrekken van een visuele gids voor de C. elegans -Gemeenschap voor het effectief uitvoeren van SWIP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een stapsgewijze protocol voor het uitvoeren van een gedrags assay, SWIP, in C. elegans. Dit protocol is eenvoudig en ongecompliceerd met geen grote technische hindernissen maken van deze test zeer gebruiker vriendelijk. Er zijn echter enkele kritieke aspecten die worden genomen moeten om het effectief uitvoeren van de bepaling.
Zorg moet worden genomen om ervoor te zorgen dat de wormen gebruikt voor de assay goed gevoed, aangezien dieet beperking SWIP<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Dr. Osama Refai van Dr. Randy Blakely van lab voor begeleiding met de geautomatiseerde analyse van SWIP. Dit werk werd gesteund door de financiering van NIH R01 DA042156 LC.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
