تصور ضعف الحواجز بطانية والدبقيه نيوروفاسكولار وحدة خلال النخاع الذاتية التجريبية في فيفو
Summary
نقدم هنا، بروتوكولات للتحقيق في الأضرار بوحدة neurovascular خلال النخاع الذاتية التجريبية المجراة. ونحن على وجه التحديد معالجة كيفية تحديد نفاذية حاجز الدم في الدماغ والنشاط جيلاتيناسي المعنية بالهجرة الكريات البيض عبر ليميتانس إطلاق.
Abstract
وحدة neurovascular (NVU) تتألف من خلايا بطانية microvascular تشكيل حاجز الدم في الدماغ (BBB)، غشاء بطانية مع جزءا لا يتجزأ من بيريسيتيس، وليميتانس إطلاق تتألف من الغشاء الطابق السفلي متني وأستروسيتيك نهاية-تغذية تبني الجانب أبلومينال من ميكروفيسيلس الجهاز العصبي المركزي (CNS). بالإضافة إلى الحفاظ على الجهاز العصبي المركزي يتحكم التوازن NVU الاتجار بالخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي. أثناء إيمونوسورفيلانسي للجهاز العصبي المركزي العدد المنخفض لتنشيط الخلايا الليمفاوية يمكن عبور حاجز غشائي دون التسبب في اختلال وظيفي BBB أو الأمراض السريرية. على النقيض من ذلك، أثناء نيوروينفلاميشن كما هو الحال في التصلب المتعدد أو نموذجها الحيواني النخاع الذاتية التجريبية (إي) عددا كبيرا من الخلايا المناعية يمكن أن يعبر بي بي بي، وبعد ذلك إطلاق ليميتانس في نهاية المطاف التوصل إلى حمة الجهاز العصبي المركزي وتؤدي إلى الأمراض السريرية. هجرة الخلايا المناعية إلى حمة الجهاز العصبي المركزي وبالتالي عملية من خطوتين ينطوي هجرة متسلسلة عبر حاجز غشائي والدبقيه NVU توظيف الآليات الجزيئية المتميزة. إذا بعد مرورهم عبر حاجز غشائي، خلايا تي اللقاء بهم مستضد المشابهة في ارتشاح خلايا مستضد تقديم ستبدأ إعادة تنشيط المحلية اللاحقة آليات تؤدي إلى تفعيل التنسيق جيلاتيناسيس، الذي سيتم تمكين الخلايا T لعبور الحاجز الدبقية وأدخل حمة الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، تقييم BBB النفاذية ونشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط في العلاقة المكانية لتراكم الخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي خلال ع على حد سواء، يسمح بتحديد فقدان سلامة حواجز NVU بطانية والدبقيه. نعرض هنا كيفية حمل ع في الفئران C57BL/6 بالتحصين النشط وكيفية تحليل في وقت لاحق نفاذية BBB المجراة باستخدام مزيج من تتبع الفلورسنت خارجية. نحن تظهر كذلك، كيفية تصور وتعريب جيلاتيناسي النشاط في أدمغة ع حسب زيموجافي في الموقع بالإضافة إلى ستينينجس إيمونوفلوريسسينت BBB الطابق السفلي الأغشية والخلايا CD45 + الغازية المناعية.
Introduction
الجهاز العصبي المركزي (CNS) وينسق جميع الجسم والوظائف العقلية في الفقاريات، والتوازن في الجهاز العصبي المركزي ضروري لاتصال سليم للخلايا العصبية. التوازن CNS تبرره وحدة neurovascular (NVU)، الذي يحمي في الجهاز العصبي المركزي من الوسط تغير من مجرى الدم. NVU يتكون من خلايا بطانية ميكروفاسكولار الجهاز العصبي المركزي، وهي فريدة من نوعها المتحلل وإقامة حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) في الحديث المتبادل المستمر مع بيريسيتيس، أستروسيتيس، والخلايا العصبية، ومكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM)، إنشاء متميزة الطابق السفلي الأغشية1. الغشاء بطانية انشيثيس هذا الجانب أبلومينال لخلايا بطانية BBB تؤوي عددا كبيرا من بيريسيتيس، وهي تتألف من α4 لامينين و α5 لامينين، بالإضافة إلى أخرى بروتينات ECM2. على النقيض من ذلك، الغشاء متني يتكون من laminin α1 و laminin α2 وهو تبني بإقدام نهاية أستروسيتيك. الغشاء الطابق السفلي متني جنبا إلى جنب مع النهاية astrocyte-الأقدام يؤلف ليميتانس إطلاق يعزل شبكة الخلايا العصبية الجهاز العصبي المركزي من ارتشاح السائل الدماغي النخاعي شغلها أو تحت العنكبوتية ممنوع3. سبب بنية فريدة من نوعها NVU، خلية محصنة ضد الاتجار بالأشخاص إلى الجهاز العصبي المركزي متميزة من أن في الأنسجة المحيطية كما أنها تتطلب عملية من خطوتين مع الخلايا المناعية، أولاً خرق BBB بطانية، وبعد ذلك إطلاق ليميتانس من أجل الوصول إلى حمة الجهاز العصبي المركزي.
التصلب المتعدد (MS) هو مرض نيوروينفلاماتوري مشتركة للجهاز العصبي المركزي، فيها عدد كبير من الخلايا المناعية بتعميم أدخل الجهاز العصبي المركزي ويسبب نيوروينفلاميشن، demyelination، وفقدان التنسيق BBB سلامة4. فقدان سلامة BBB أوائل مميزة لمرض التصلب العصبي المتعدد، كما أشارت إلى وجود تباين غادولينيوم تعزيز آفات في الجهاز العصبي المركزي كتصور بالتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)5. التسرب الكريات البيض في الجهاز العصبي المركزي تحدث على مستوى الأوردة بوستكابيلاري؛ ومع ذلك، تظل الآليات الدقيقة التي تشارك في ديابيديسيس الخلايا المناعية عبر غشاء الطابق السفلي BBB وحاجز الدبقية في وقت لاحق إلى استكشاف. النخاع الذاتية التجريبية (ع) بمثابة نموذج لحيوانات لمرض التصلب العصبي المتعدد، وقد ساهم مساهمة كبيرة في معرفتنا الحالية حول مرض التصلب العصبي المتعدد المرضية. على سبيل المثال، باستخدام نموذج إي أنه تم اكتشاف أن يحدث التسرب الكريات البيض في عملية متعددة الخطوات، بما في ذلك التقاط أولى والمتداول خطوة بوساطة سيليكتينس وجزيئات الميوسين الشبيهة مثل سيليكتين ف بروتين سكري [ليغند] (بسجل)-1، تليها إنتغرين-تعتمد على اعتقال الراسخ والزحف من خلايا تي على BBB خلايا بطانية للجانبين المتساهلة ديابيديسيس6.
مرة واحدة قد عبروا خلايا تي بي بي بي بطانية والغشاء بطانية، يحتاجون إلى اللقاء بهم مستضد المشابهة في الضامة أو الخلايا الجذعية استراتيجيا في المسافات ليبتومينينجيل أو ارتشاح مترجمة. يدفع هذا التفاعل إنتاج المحورية من الوسطاء المحترفين التحريضية الزناد تلك الآليات التالية اللازمة لغزو أنسجة الجهاز العصبي المركزي من الخلايا المناعية عبر إطلاق ليميتانس7،،من89. تفعيل التنسيق مصفوفة-ميتالوبروتيناسيس (MMP)-2 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-9 يغير التنشيط تشيموكيني ويؤدي إلى تدهور مستقبلات مصفوفة خارج الخلية في نهاية أستروسيتي-أقدام، وشرط مسبق للمناعة الخليوي الهجرة عبر ليميتانس إطلاق في حمة الجهاز العصبي المركزي، والحث على ظهور الأعراض السريرية من ع10،11.
الجمع بين الكشف عن الجهاز العصبي المركزي التسلل إلى الخلايا المناعية مع بي بي بي نشاط التسرب وجيلاتيناسي في مقاطع أنسجة الجهاز العصبي المركزي يوفر معلومات قيمة حول سلامة وظيفية حاجز غشائي والدبقيه في سياق neuroinflammation. على سبيل المثال، نحن مؤخرا التحقيق فقدان التأسيسي للجزيء الالتصاق هالة جزيء مفرق ضيق غشائي (جام)-ب في الاتجار بالخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي في سياق إي. بالمقارنة مع صحية البرية من نوع C57BL/6 الفئران، أظهرت صحي المربي-ب-ناقص ليتيرماتيس ليس الأضرار بسلامة BBB كما هو موضح بتقييم نفاذية المجراة باستخدام تتبع الذاتية فضلا عن الخارجية12. في سياق ع، أظهرت الفئران جام-ب-ناقص C57BL/6 أعراض المرض يحسن، الذي ارتبط بمحاصرة الخلايا الملتهبة في ليبتومينينجيل وارتشاح ممنوع12. لدراسة هذه الظاهرة طبقنا في الموقع زيموجرافي، يسمح تحديد النشاط جيلاتيناسي لاختبار ما إذا كان انعدام النشاط جيلاتيناسي في جام-ب-ناقص الفئران قد تكون مسؤولة عن انخفاض عدد الخلايا المناعية قادرة على خرق إطلاق ليميتانس12.
نظراً للتوفر مختلف وراثيا الماوس النماذج التي تفتقر إلى مثل الجزيئات مفرق ضيق BBB المختلفة التي قد تتسبب في تغييرات في وظيفة بي بي بي، والمنهجيات اللازمة للتحقيق في سلامة BBB مهمان. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر الأدوية المطورة حديثا على الحواجز NVU. هنا نعرض كيفية حمل ع في الفئران C57BL/6 بالتحصين النشط مع بروتين سكري oligodendrocyte المايلين (موج)-الببتيد aa35-55 في مأمونية كاملة فروند. ثم نشرح كيفية تعريب تسلل الخلايا المناعية عبر حواجز بطانية والدبقيه NVU وكيفية دراسة سلامة المجراة في حاجز غشائي والدبقيه بالكشف في الموقع تتبع الخارجية والنشاط جيلاتيناسي، على التوالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم هنا، بروتوكولا للحث ورصد ع الإناث C57BL/6 الفئران. الإناث ويتم اختيار تفضيلي، وهناك نسبة نساء: الرجال 3:1 في مرض التصلب العصبي المتعدد. لتقييم مدى خطورة EAE، قدمنا استخدام ورقة سجل 3 نقاط. وسجل خطورة ع هو عموما فيما يتعلق بخطورة الاختلالات الحركية. الفئران مع تقدم مراحل ع، نستعرض أي نقاط أعلا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعترف مع الامتنان Sorokin ليديا، الذي قد يشارك في بلدها الأصلي في الموقع زيموجرافي البروتوكول10 معنا.
Materials
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
References
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
- Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
- Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
- Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
- Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
- Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
- Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
- Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
- Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
- Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
- Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
- Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
- Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, (2007).
- Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
- Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis–a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
- Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
- Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
- Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
- Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
- Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
- Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
- Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
- Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
- Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
- Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).
